Development of novel coatings for gene-eluting stent applications

The overall goal of this thesis was the development of novel coatings for AISI 316L substrates, to be applied in gene-eluting stent applications for the treatment of artery-related diseases. Particularly, it aimed at the realization of platforms able to directly anchor non-viral gene delivery particles on their surface and exert surface-mediated gene delivery. The major challenges toward the realization of a reliable gene-eluting stent (GES) apparatus are the realization of stable, biocompatible and anti-thrombogenic biomaterial surfaces capable to immobilize gene delivery vectors and allow their interaction with cells upon implantation. In this context, AISI 316L was chosen as starting material, since it is the most commonly used austenitic stainlesssteel metal for stents and biomedical applications in general; then, an electropolishing process was performed to decrease its superficial roughness, and finally, two superficial modifications were investigated in parallel. The first concerned the deposition of a reactive polydopamine (PDA) coating, while the second one was based on the functionalization of the former with glutaric anhydride (GLU), to introduce carboxylic acids on the surface. The choice of these treatments was done according to the overall goal of this work of being able to attach on them PEI-based polyplexes, thus positively charged structures, bearing amine groups at surface. Particularly, the main hypothesis at the base of the work are that PEI-based polyplexes react with PDA forming covalent bonds, while, with GLU through electrostatic interactions. The developed surface treatments were characterized in terms of morphological and physicochemical properties, from which the success of the different modification protocols was confirmed and a good cytocompatibility was observed, making them promising for biomedical applications. Furthermore, PDA and GLU ability to immobilize on the surface amine-bearing sub-micrometric particles was investigated and the stability of the deposition was assessed by either simple washing in PBS and under flow reproducing quasi-physiological shear stresses occurring in vivo in coronary arteries. Both PDA and GLU surfaces allowed to increase particle deposition with respect to unmodified electropolished stainless steel, with GLU reaching very high surface coverage values of about 80%; furthermore, the particles demonstrated to be quite stably attached to the surfaces even under flow. Finally, preliminary surface-mediated transfection tests were performed using bPEI-based polyplexes on HeLa cells, but with limitedly satisfactory results. Hence, further optimization of the polyplex type and of the polyplex deposition will be necessary to take advantage of the properties of the well-developed coatings for surface-mediated gene delivery.

L'obiettivo generale di questa tesi è stato lo sviluppo di nuovi rivestimenti da applicare su substrati in acciaio inossidabile AISI 316L, per la realizzazione di gene-eluting stent, ovvero, apparecchi destinati al trattamento di malattie cardiovascolari. In particolare, questo lavoro ha mirato alla realizzazione di piattaforme che fossero in grado di immobilizzare sulla loro superficie vettori non-virali, al fine di permettere il rilascio di materiale genetico esogeno da superficie (surface-mediated gene delivery). Le sfide che caratterizzano la realizzazione di tali dispositivi, definiti Gene-eluting stent (GES), sono la realizzazione di un biomateriale stabile, biocompatibile e anti-trombogenico, in grado di immobilizzare e mantenere i vettori in superficie, al fine di promuovere e sostenere la loro associazione e internalizzazione cellulare. Dunque, partendo da un substrato in acciaio inossidabile AISI 316L, il quale è il metallo austenitico più comunemente usato per la produzione di stent e in generale per applicazioni biomediche, un processo di lucidatura elettrochimica è stato eseguito per diminuire la rugosità dello strato di ossido superficiale, ed ottenere cosi una superficie più pulita e chimicamente più omogenea. Successivamente, a partire da tali superfici, due rivestimenti superficiali sono stati indagati in parallelo: il primo è stato realizzato con deposizione di sola polidopamina (PDA), mentre il secondo, mediante una funzionalizzazione del precedente con anidride glutarica (GLU). La scelta di questi trattamenti è stata eseguita al fine di sfruttare le proprietà adesive, la stabilità e la reattività chimica della polidopamina (PDA), con l'obiettivo finale di immobilizzare su di essi, poliplessi generati mediante l’utilizzo di polietilenimmina (PEI), ovvero strutture cariche positivamente, aventi gruppi amminici in superficie. In particolare, l'ipotesi principale alla base del lavoro è che tali complessi reagiscano con il rivestimento in PDA formando legami chimici covalenti, mentre, con il PDA funzionalizzato (GLU) attraverso interazioni elettrostatiche. I rivestimenti superficiali sviluppati, sono stati caratterizzati sia morfologicamente, sia in termini di proprietà fisico-chimiche. Inoltre, per l'analisi biologica delle superfici, sono stati eseguiti test di citotossicità, sia diretti che indiretti. Successivamente, è stata indagata la capacità di entrambi i rivestimenti di immobilizzare particelle sub-micrometriche aventi ammine primarie in superficie, sia mediante semplice lavaggio in PBS, sia attraverso test dinamici sotto flusso, riproducendo sforzi di taglio quasi fisiologici che si verificano in vivo nelle arterie coronarie. In entrambi i test è emersa la grande capacità del rivestimento ottenuto con anidride glutarica (GLU) di immobilizzare i vettori in superficie, e di mantenere tale legame stabile nel tempo. Infine, sono stati depositati sulle superfici precedentemente descritte, poliplessi generati miscelando bPEI e pGLuc-Basic Vector, con lo scopo di poter effettuare preliminari test di trasfezione su cellule HeLa. Tuttavia, i risultati ottenuti suggeriscono come un’ulteriore ottimizzazione, sia del tipo di poliplesso che della sua tecnica di deposizione, sarà necessaria per poter usufruire al meglio delle potenzialità mostrate dai trattamenti superficiali proposti in questo lavoro.