Development of novel bioreactors for oesophageal and parenchymatous organs tissue engineering

Most congenital gastrointestinal anomalies result in some type of obstruction, frequently manifesting with feeding difficulties, abdominal distention, and emesis at birth or within the first days. Oesophageal atresia is the most common gastrointestinal atresia, with an estimated incidence of 1 in 3500 live births. Atresia is a congenital absence or closure of a normal body opening or tubular structure and is associated with disorders present in different parts of the body. Gastric pull-up, colon transposition and jejunum transposition represent the most endorsed treatments for long-gap oesophageal atresia. However, these procedures are afflicted by common severe complications that most often lead to later life further problems in operated children. Besides, a life-long immunosuppression is often needed. These problems leaded to the search for alternative therapeutic strategies, and tissue engineering comes within this context. The main work presented in this thesis involves the development of a novel bioreactor used in the dynamic culture of a porcine-derived oesophagus. The bioreactor allows an adjustable set-up for the culture, basing on the organ’s size. The dynamic culture included the harvesting of the oesophagus, the decellularization of the organ in order to remove the native cellular content, and successive re-population of the decellularized scaffold with human mesoangioblasts and human fibroblasts. The decellularization process of an organ discharges most of the original cellular material while aiming to retain the native organ architecture, obtaining a scaffold. The scaffold can be seeded with suitable cells and cultured in vitro to obtain a functional tissue suitable to transplantation. The bioreactor developed in this work was used for both decellularization and recellularization. The tissue analysed at the end of the dynamic culture showed clusters of cells re-populating areas of the scaffold where they started a local remodelling of the organ’s internal structures. The realized bioreactor allows different size oesophagi to be cultured and its application could in the future be extended to all luminal organs. In this thesis is also presented an additional work comprising the design of a bioreactor addressed to the dynamic culture of all parenchymatous organs. The work performed is relative to the design, construction and assessment of the sterility properties of the bioreactor. In a future perspective, the inclusion of this bioreactor in a dynamic culture of a parenchymatous organ (e.g. liver or kidney), can bring further assessments on its suitability for tissue engineering purposes.

La maggior parte delle anomalie congenite del tratto gastrointestinale sono caratterizzate da ostruzioni di vario tipo, che si manifestano frequentemente con difficoltà nell’alimentazione, distensione addominale ed emesi, alla nascita nei primi giorni di vita successivi. L’atresia esofagea è il tipo di atresia più comune del tratto gastrointestinale, con un’incidenza stimata di 1 su 3500 nativi vivi. L’atresia è un’assenza o una chiusura congenita di un orifizio o una struttura tubulare normalmente aperti, ed è associata con vari disordini in altre parti del corpo. Pull-up gastrico, trasposizione del colon e del digiuno rappresentano ad oggi i trattamenti più utilizzati nel caso di atresia esofagea di tipo long-gap. A questi interventi sono però associate severe complicazioni che possono successivamente portare ad ulteriori problemi nel corso della vita dei bambini operati. Inoltre, spesso è necessaria una terapia immunosoppressiva a vita. Queste controindicazioni hanno spinto nella direzione della ricerca di terapie alternative, ed è in questo ambito che l’ingegneria tissutale fa la sua comparsa. Il lavoro principale che viene presentato in questa tesi è incentrato sullo sviluppo originale di un bioreattore utilizzato nella coltura dinamica di un esofago di maiale. Il bioreattore permette di essere regolato sulla base delle dimensioni dell’organo in coltura. La coltura dinamica prevedeva l’estrazione chirurgica dell’esofago, la relativa decellularizzazione al fine di rimuovere il contenuto cellulare nativo, e il successivo ripopolamento dello scaffold decellularizzato con mesoangioblasti e fibroblasti, entrambi di provenienza umana. Il processo di decellularizazione di un organo mira a scartare la gran parte del materiale cellulare originale mantenendo però l’architettura nativa dell’organo, ottenendo uno scaffold. Lo scaffold può essere seminato con determinate cellule e coltivato in vitro per ottenere un tessuto funzionale adatto al trapianto. Il bioreattore sviluppato in questo lavoro è stato usato sia per la decellularizzazione che per la ricellularizzazione. Il tessuto analizzato alla fine della coltura ha mostrato la presenza di agglomerati di cellule in determinate zone, in corrispondenza delle quali era rilevabile un iniziale rimodellamento delle strutture interne native dell’organo. Il bioreattore realizzato permette la coltura di esofagi di differenti dimensioni e in future la sua applicazione potrebbe essere estesa all’intera classe degli organi luminali. In questa tesi viene presentato anche un lavoro aggiuntivo che comprendeva il design di un bioreattore rivolto alla coltura dinamica di tutti gli organi parenchimatosi. Il lavoro eseguito è relative al design, alla costruzione e alla valutazione della sterilità di tale bioreattore. In una prospettiva futura, l’utilizzo di questo bioreattore nell’effettiva coltura dinamica di un organo parenchimatoso (e.g. fegato o reni) può condurre a ulteriori valutazioni sulla sua idoneità all’uso nell’ambito dell’ingegneria tissutale.