Experimental analysis of hemocompatibility-related adverse events in the setting of LVAD support : the competing role of von Willebrand factor disease, prothrombotic platelet activation and antithrombotic therapy

Background: Advanced Heart Failure (aHF) represents the advanced phase of multiple pathological conditions of the heart and coronary arteries. This condition leads to a compromised heart function and, consequently, to an inadequate cardiac output. To date, preventive measures and medical therapies are not able to contrast and/or reduce aHF morbidity and mortality. The only resolutive therapy is heart transplant but the demand for the organ has exceeded the availability of donor heart and there are rigid selection criteria for transplant candidates. Thanks to bioengineering’s developments over the last 50 years, mechanical circulatory support (MCS) devices are today an effective solution for the treatment of patients affected by aHF. Among these, the most suitable devices for long-term treatment are ventricular support devices (VAD), in particular continuous flow VAD for the left ventricle (CF-LVAD). LVADs are electrical miniaturized mechanical pumps with an internal rotating impeller (axial or centrifugal) that provides the propulsive energy needed to pump a continuous flow of blood from the apex of the left ventricle to the aorta. Accordingly, the device mechanically supports the pumping function of the left ventricle and, in the most severe pathologies, completely replaces it. Despite latest generation CF-LVADs demonstrated significant technological progress, which assured a progressive increase in patient survival and overall outcome improvement, LVAD therapy remains plagued by post-implant complications due to the non-physiological pump-patient interaction. In particular hemocompatibility-related adverse events (HAREs, namely thrombosis and bleeding) severely affect long-term outcomes. Thrombotic complications (pump thrombosis or ischemic stroke), besides the interaction between blood components and device surface, can be principally attributed to the non-physiologic blood flow patterns characterizing the device. Indeed, LVADs operate at very high rotational speeds to achieve physiological cardiac outputs, which generate high turbulent and non-physiological shear-stress levels (100 – 500 Pa). As a result, platelets are exposed to elevated mechanical loading, which acts as agonist for platelet activation (PA), leading to thrombus formation. In the same way, bleeding complications are determined by the enzymatic degradation of von Willebrand factor (vWf), translating in the loss of its high-molecular weight (HMW) multimers, caused by the supraphysiological shear stress imposed by the pump. The qualitative and quantitative deficiency of these multimers reflects a deficit in factor’s functional activity. In order to limit the prothrombotic platelet activity and prevent thrombosis, LVAD patients are routinely administered with a combination of antiplatelets and antithrombotic (AT) drugs (usually Aspirin (ASA) and Warfarin, respectively). Nonetheless, AT therapy do not totally eliminate the risk of thrombosis as a consequence of the so-called drug “resistance”, which includes a portion of patients who are insensitive to drug loading. Moreover, the lack of a patient-specific AT regimen could lead to under-coagulation, enhancing pump thrombosis, or to over-coagulation, which induces, in turn, bleeding events13. To date, few studies focused on the fragile balance between the factors responsible for hemorrhagic and thrombotic events. The present study is part of a research project born from the collaboration between the Biomechanics group of the Department of Electronics, Information and Bioengineering (DEIB) of Politecnico di Milano and Vita Salute San Raffaele University (UniSR) of Milan, and aims at experimentally analyzing the competing role of i) von Willebrand factor disease, ii) platelet activation, and iii) antithrombotic therapy to the occurrence of HRAEs in LVAD patients. Materials and Methods: Experimental activities have been performed into the Haemostasis and Thrombosis Research Laboratory of San Raffaele Hospital (HSR). The Platelet Activity State (PAS) assay was used to evaluate the platelet prothrombotic activity whereas an Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) evaluated the degradation profile of vWf. Moreover, standard coagulation parameters (hematocrit, hemoglobin, platelet count, INR, aPTT, fibrinogen and D-Dimer) and occurrence of HRAEs were recorded, and clinical outcomes correlated to the antithrombotic regimen. Patients were classified in two groups: patients who did not develop a bleeding event (control group) and patients who did (study group). Data were compared at three different time points: T0 (pre-implant), T1 (early-term follow up) and T2 (long-term follow-up); in addition, consistent with the change in antithrombotic therapy (ASA discontinuation) that followed a bleeding event, data from patients of the study group were compared pre- and post- ASA discontinuation. The experimental protocol for the PAS assay requires the collection of platelet rich plasma (PRP) from a whole blood sample taken from a cf-LVAD patient. The PRP is filtered through a gel-filtration column to obtain a suspension of platelets (Gel-Filtered Platelets, GFP) free of plasma components, which is then diluted to a constant concentration of 20.000 plt/μL. The platelets are then exposed to Ac-FII for 10 minutes at 37 °C – in addition to FXa and Ca2+ needed to rebuild the prothrombinase complex – to quantify the thrombin production rate as a marker of PA. The amount of thrombin generated from the GFP sample is quantified by spectrophotometric analysis, where chromozyn-TH is the thrombin-specific chromogenic peptide substrate. The spectrophotometer detects the dynamics of absorbance values variation over a predetermined time interval: the slope of the line that interpolates the absorbance-time data points is an index of the thrombin quantity produced by the platelet sample. The analysis is performed both on a non-stimulated GFP sample and on a sonicated GFP sample (for 10 seconds, 20 W). The PA level of the subject (PAS value) is expressed as a percentage of its maximum potential of activation – i.e. PAS value obtained from the sonicated sample. For each patient, the PAS assay has been performed in duplicate to increase data consistency. ELISA experimental protocol consists in a series of steps to measure the ability of von Willebrand factor to bind collagen (vWf:CB). This ability is strictly related to the presence pf vWf HMW multimers. A reduced rate of vWf collagen binding activity is an indicator of the loss of these multimers and, consequently, to a degraded profile of the factor. The test principle regards the measurement of vWf, which is captured through HMW multimers by human collagen coated on the internal walls of a plastic microplate well. Then, rabbit anti-vWf antibodies coupled with peroxidase bind to the remaining free antigens of the bound vWf. The bound enzyme peroxidase is revealed by the addition of tetramethylbenzidine (TMB) substrate. The intensity of the color read by a spectrophotometer is directly proportional to the initial concentration of vWf in the plasma sample. Results: The study population comprises 45 patients implanted with a CF-LVAD with the indication for destination therapy. Of these, 17 (38%) are in the control group and 28 (62%) in the study group. In the control group, 2 (12%) patients suffered a thrombotic event. In the study group, bleeding events were followed by ASA withdrawal for 26 (93%) out of 28 patients; before ASA suspension, 1 (4%) patient suffered a thrombotic event whereas after ASA suspension 5 (19%) patients developed a bleeding event and 1 (4%) a thrombotic event. Considering the two tested groups (control vs. study), analyzes were carried to compare both vWf collagen binding activity and PAS values. Regarding the first factor, the overall population is subjected to a statistically significant reduced vWf activity over time of LVAD support. However, no differences were detected between the two groups. Similarly, analysis of vWf:CB pre- vs. post- ASA discontinuation did not reveal a significant difference. Regarding PAS values, no significant changes were registered in the overall population. Similarly, no statistically significant changes were noted between the two groups. On the other hand, ASA suspension induced a significant - but low-magnitude - increase in PAS values. In addition, the sub-analysis related to the different pump models implanted (HM3 vs. HVAD) showed no statistically variations in both vWf:CB and PAS values. Conclusions: Experimental analyzes of the factors responsible for HRAEs in LVAD patients suggest that patients who suffer from thrombotic and bleeding complications are characterized by comparable profile of PA (consistent with no significant differences in PAS values) and degradation of vWf HMW multimers. Interestingly, a variation in the antithrombotic pharmacological therapy may effectively contribute to reduce the incidence of hemorrhagic events and, in parallel, not significantly increase the thrombotic risk. Moreover, the results of this study highlight the need of tailoring the antithrombotic strategy to patient-specific hemostatic profile; in this perspective, combining constant monitoring of PA and patients clinical status, emerge as a valuable strategy to preserve the delicate balance within the two arms of coagulation complications (hemorrhagic and thromboembolic).

Introduzione: L’insufficienza cardiaca avanzata (advanced Heart Failure, aHF) rappresenta la fase inoltrata di molteplici condizioni patologiche del muscolo cardiaco e delle arterie coronarie. Questa condizione conduce ad uno stato alterato delle funzionalità del cuore e, di conseguenza, ad una inadeguata portata cardiaca. Ad oggi, le misure preventive e le terapie mediche non sono in grado di contrastare e/o ridurre la morbosità e la mortalità associate all’insufficienza cardiaca avanzata. L’unica terapia risolutiva è il trapianto cardiaco, tuttavia la richiesta supera di gran lunga la disponibilità di donatori e i candidati al trapianto sono soggetti a rigidi criteri di selezione. Grazie alle innovazioni degli ultimi 50 anni nel campo dell’ingegneria biomedica, i dispositivi meccanici di supporto circolatorio (Mechanical Circulatory Support devices, MCS devices) rappresentano oggi una valida soluzione per il trattamento di pazienti affetti da aHF. Tra questi, i dispositivi che si adattano maggiormente al trattamento a lungo termine sono i dispositivi di assistenza ventricolare (Ventricular Assist Devices, VAD), in particolare i dispositivi VAD a flusso continuo per il supporto funzionale del ventricolo sinistro (Continous Flow-Left Ventricular Assist Devices, CF-LVADs). Allo stato dell’arte, questi dispositivi sono pompe miniaturizzate impiantabili, alimentate elettricamente, all’interno dei quali un impeller rotante (assiale o centrifugo) fornisce l’energia propulsiva necessaria a direzionare il flusso continuo di sangue dall’apice del ventricolo sinistro all’aorta. In questo modo, il dispositivo fornisce un supporto meccanico all’azione di pompa del ventricolo sinistro e, nei casi di patologie più severe, la sostituisce completamente. Nonostante gli LVAD a flusso continuo di ultima generazione abbiano dimostrato un grande progresso tecnologico, il quale ha permesso un considerevole aumento della prospettiva e della qualità di vita dei pazienti, questo tipo di supporto presenta severe complicanze post-impianto dovute all’interazione non fisiologica tra pompa e flusso sanguigno. Le complicanze trombotiche (trombosi della pompa o ictus ischemico), oltre all’interazione tra le componenti ematiche ed il dispositivo, sono principalmente attribuite al flusso emodinamico non fisiologico imposto dalla pompa. Infatti, CF-LVAD opera ad elevate velocità di rotazione dell’impeller della pompa, necessarie a garantire portate sanguigne fisiologiche, che generano elevati e non fisiologici sforzi di taglio (100-500 Pa). Questi ultimi agiscono come agonisti dell’attivazione piastrinica, componente fondamentale nella generazione del trombo. Allo stesso modo, le complicanze emorragiche dipendono dagli elevati sforzi di taglio che determinano una progressiva degradazione enzimatica del fattore di von Willebrand (von Willebrand factor, vWf) che si traduce nella perdita di multimeri ad alto peso molecolare (high-molecular weight multimers, HMWMs); la carenza di questi multimeri comporta una riduzione dell’attività funzionale del fattore. Per limitare l’attività protrombotica delle piastrine e prevenire l’insorgenza di trombi, ai pazienti portatori di LVAD viene normalmente somministrata una terapia combinata di farmaci antipiastrinici ed antitrombotici (in genere Warfarin ed Aspirina (ASA), rispettivamente). Tuttavia, la terapia non elimina completamente il rischio trombotico, specialmente nel caso si sviluppasse una resistenza al farmaco, condizione riguardante gruppi di pazienti in cui l’efficacia del farmaco risulta notevolmente ridotta o inesistente. In aggiunta, l’assenza di regimi antitrombotici paziente-specifici possono comportare situazioni di ipocoagulazione, con elevato rischio di trombosi della pompa, o di ipercoagulazione che, al contrario, può indurre emorragie. Finora, la letteratura presenta pochi studi riguardanti la relazione che intercorre tra i fattori responsabili del rischio trombotico ed emorragico e la terapia antitrombotica somministrata. Il presente lavoro di tesi si inserisce in un progetto di ricerca nato dalla collaborazione tra il Gruppo di Biomeccanica del Dipartimento di Elettronica, Informazione e Bioingegneria (DEIB) del Politecnico di Milano e l’Università Vita-Salute San Raffaele (UniSR) di Milano. L’obiettivo dello studio riguarda l’analisi dell’azione competitiva tra la sindrome del fattore di von Willebrand acquisita, l’attivazione piastrinica e la terapia antitrombotica nell’occorrenza di eventi avversi (trombotici ed emorragici). Materiali e Metodi: Le attività sperimentali sono state svolte presso il Laboratorio di Ricerca di Emostasi e Trombosi presso l’Ospedale San Raffaele (OSR). Sono stati utilizzati due saggi chimici per valutare, rispettivamente, l’attività protrombotica delle piastrine e il profilo di degradazione del vWf: Platelet Activity State (PAS) assay e Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA). Nello studio sono stati coinvolti pazienti portatori di CF-LVAD e sono stati suddivisi in due gruppi: pazienti che non hanno avuto un evento di sanguinamento (gruppo di controllo) e pazienti che ne hanno sofferto (gruppo di studio). I dati sono stati confrontati a tre differenti istanti temporali: T0 (pre-impianto), T1 (breve periodo post-impianto) e T2 (lungo periodo post-impianto); inoltre, i pazienti del gruppo di studio che hanno sospeso la terapia antitrombotica, a seguito dell’evento di sanguinamento, sono stati valutati anche nei periodi pre- e post-sospensione del farmaco (ASA). I risultati sono stati poi confrontati con i parametri clinici ed il profilo coagulativo di ciascun paziente, misurati durante la campagna sperimentale, così da avere un ulteriore confronto con lo stato coagulativo dei pazienti portatori di un CF-LVAD. Infine, per ciascun gruppo, sono stati registrati gli eventi avversi di natura trombotica ed emorragica. Il protocollo sperimentale per il PAS assay prevede l’estrazione del plasma ricco di piastrine (PRP), in seguito a centrifugazione, da un campione di sangue intero prelevato da un paziente portatore di cf-LVAD. Il PRP viene filtrato mediante una colonna per filtrazione su gel per ottenere una sospensione di piastrine priva delle componenti plasmatiche (Gel-Filtered Platelets, GFP), che viene successivamente diluita fino a raggiungere una concentrazione costante di 20.000 plt/μL. Le piastrine vengono quindi esposte al Ac-FII per 10 minuti a 37°C – in aggiunta di FXa e di Ca2+ necessari per ricostruire il complesso protrombinasi – al fine di quantificare la produzione di trombina, marcatore universalmente riconosciuto della PA. La quantità di trombina generata dal campione viene quantificata da un’analisi spettrofotometrica, grazie all’aggiunta della cromazina-TH come substrato peptidico cromogenico specifico per la trombina. Lo spettrofotometro rileva la dinamica di variazione del valore di assorbanza del campione durante un intervallo di tempo prestabilito (7 minuti): la pendenza della retta interpolante i punti assorbanza-tempo è indice della quantità di trombina prodotta. L’analisi viene eseguita sia su un campione di GFP non stimolato (basale) sia su un sonicato (per 10 secondi a 20 W). Il livello di PA del soggetto in esame (valore di PAS) viene espresso in termini percentuali rispetto al suo massimo potenziale di attivazione, ottenuto dal campione sonicato. Il protocollo sperimentale per l’ELISA consiste in una serie di passaggi per misurare la capacità del vWf di legarsi al collagene (vWf collagen binding, vWf:CB). Questa funzione è strettamente connessa alla presenza di HMWM; pertanto, una ridotta attività del fattore verso il collagene rappresenta un indicatore della mancanza di questi multimeri e, conseguentemente, della sua degradazione. Il principio del test si basa sulla misurazione della concentrazione di vWf nel plasma testato, il quale si lega, mediante i suoi HMWM, al collagene umano adsorbito sul fondo dei pozzetti della piastra utilizzata. Successivamente, vengono incubati anticorpi specifici per il vWf, i quali sono coniugati ad un enzima (perossidasi) che consente la conversione del substrato da incolore a colorato. Questa conversione avviene mediante la reazione chimica tra l’enzima perossidasi e l’aggiunta di tetrametilbenzidina (TMB). L’intensità del colore sviluppato, letta mediante uno spettrofotometro, è direttamente proporzionale alla concentrazione iniziale di vWf nel campione di plasma testato. Risultati: La popolazione di studio è composta da 45 pazienti impiantati con indicazione al trattamento DT. Di questi, 17 (38%) appartengono al gruppo di controllo e 28 (62%) al gruppo di studio. Nel gruppo di controllo, 2 (12%) pazienti hanno sviluppato un evento trombotico. Nel gruppo di studio, a seguito degli eventi di sanguinamento, 26 (93%) pazienti su 28 hanno sospeso il farmaco ASA; prima della sospensione, 1 (4%) paziente ha sofferto di un evento trombotico mentre dopo la sospensione 5 (19%) pazienti sono andati incontro ad un evento di sanguinamento e 1 (4%) paziente ad uno trombotico. Considerando i due gruppi testati (controllo vs. studio), le analisi sono state condotte con l’intento di confrontare l’attività del vWf nel legarsi al collagene e i valori di PAS. Nel caso del vWf, la popolazione nel complesso ha mostrato una riduzione significativa dell’attività del fattore nel tempo. Al contrario, sia il confronto tra gruppi sia il confronto tra pre- e post-sospensione di ASA non hanno mostrato variazioni significative dei valori di vWf:CB. Osservando invece i valori di PAS, nessuna variazione statisticamente significativa nel tempo è stata registrata sia considerando la popolazione nel complesso sia effettuando un confronto tra i due gruppi. Al contrario, le due condizioni pre- e post-sospensione ASA hanno mostrato differenze significative in termini di PAS. In aggiunta, è stata condotta una sub-analisi relativa ai diversi modelli di pompa impiantati nei pazienti testati (HM3 vs. HVAD); i risultati hanno mostrato che non vi è nessuna differenza statistica osservabile tra le due pompe sia per i valori di vWf:CB sia per quelli di PAS. Conclusioni: Le analisi sperimentali condotte, considerando sia le cause emorragiche sia quelle trombotiche nei pazienti testati, suggeriscono che una variazione nella terapia farmacologica antitrombotica potrebbe contribuire alla riduzione dell’incidenza di eventi emorragici nel contesto di LVAD e, allo stesso tempo, non determinerebbe un aumento significativo del rischio trombotico. Si sottolinea inoltre la necessità di strategie farmacologiche paziente-specifiche che, abbinate ad un monitoraggio costante dell’attivazione piastrinica e dello stato clinico del paziente, contribuirebbero a preservare il delicato equilibrio esistente tra i due rami delle complicanze coagulative (emorragiche e tromboemboliche).