High-speed multiplex CARS microscopy in the entire Raman-active region through supercontinuum generation in bulk media

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) microscopy is a label-free vibrational imaging technique delivering chemical maps of cells and tissues. With respect to Spontaneous Raman (SR), CARS provides several orders of magnitude higher speed by exploiting third-order nonlinear optical processes occurring between the sample and the impinging electric fields. The simplest CARS implementation employs two narrowband picosecond pulses (pump and Stokes) that are spatiotemporally superimposed at the sample plane to probe a single vibrational mode. Broadband CARS (BCARS) combines narrowband pump pulses with broadband Stokes pulses to record broad vibrational spectra, thus combining the high acquisition speed of single-frequency CARS with the chemical specificity of SR. Despite many improvements in the last decade, BCARS microscopes struggle to work in the so-called “fingerprint” spectral region (400-1800 cm-1), because it features a weaker Raman response than the high-frequency CH-stretching region (2800-3100 cm-1). Here, we demonstrate a novel approach to BCARS to collect the full Raman spectrum (400-3100 cm-1). The experimental setup starts with a 2-MHz repetition rate femtosecond fiber laser centered at 1035 nm. The system delivers high energy (≈ 2 µJ) pulses used for generating sub-20 fs broadband Stokes pulses (1050-1600 nm) by white-light continuum in a bulk YAG crystal, a compact and alignment-insensitive technique. Combining them with 3.7 ps narrowband pump pulses, we can generate CARS signal with high spectral resolution (< 10 cm-1) in the entire Raman window exploiting both two-color and three-color excitation mechanisms. The reduced repetition rate unlocks two other key advantages of the system. On the one hand, it entails a longer delay (0.5 µs) between two consecutive pulses, enabling thermal energy dissipation; on the other hand, for a given average power limited by sample degradation, higher pulse energies results in higher peak intensities, generating a stronger CARS signal thus increasing the signal-to-noise ratio and/or the acquisition speed. The system is equipped with a homemade transmission microscope to image cells and tissues at high-speed (< 3 ms) with a large field of view (>800*800 µm^2). Using a novel post-processing pipeline, we deliver high-quality chemical maps, distinguishing the main chemical compounds in cancer cells and identifying cancer in liver slices of mouse models, unveiling the path for applications in histopathological settings.

La microscopia coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) è una tecnica di imaging vibrazionale senza etichette che fornisce mappe chimiche di cellule e tessuti. Rispetto al Raman spontaneo (SR), la tecnica CARS fornisce una velocità superiore di diversi ordini di grandezza sfruttando i processi ottici non lineari di terzo ordine che si verificano tra il campione e i campi elettrici che lo colpiscono. L'implementazione CARS più semplice impiega due impulsi a picosecondi a banda stretta (pompa e Stokes) che sono sovrapposti spaziotemporalmente sul campione per sondare un singolo modo vibrazionale. La tecnica broadband CARS (BCARS) combina impulsi di pompa a banda stretta con impulsi di Stokes a banda larga per registrare ampi spettri vibrazionali, combinando così l'elevata velocità di acquisizione della tecnica CARS a frequenza singola con la specificità chimica del SR. Nonostante i numerosi miglioramenti nell'ultimo decennio, i microscopi BCARS faticano a lavorare nella cosiddetta regione spettrale della "fingerprint" (400-1800 cm-1), perché presenta una risposta Raman più debole rispetto alla regione dei CH-stretching ad alta frequenza (2800 -3100 cm-1). In questa tesi, dimostro un nuovo approccio a BCARS per raccogliere l'intero spettro Raman (400-3100 cm-1). La configurazione sperimentale inizia con un laser a fibra a femtosecondi con frequenza di ripetizione di 2 MHz centrato a 1035 nm. Il sistema fornisce impulsi ad alta energia (≈ 2 µJ) utilizzati per generare impulsi Stokes a banda larga inferiori a 20 fs (1050-1600 nm) mediante generazione di supercontinuo in un cristallo YAG, una tecnica compatta e insensibile all'allineamento. Combinandoli con impulsi di pompa a banda stretta da 3,7 ps, possiamo generare segnali CARS con alta risoluzione spettrale (<10 cm-1) nell'intera finestra Raman sfruttando meccanismi di eccitazione sia a due che a tre colori. La ridotta frequenza di ripetizione sblocca altri due vantaggi chiave del sistema: da un lato, comporta un ritardo più lungo (0,5 µs) tra due impulsi consecutivi, consentendo la dissipazione dell'energia termica; d'altra parte, per una data potenza media limitata dal degrado del campione, energie di impulso più elevate si traducono in intensità di picco più elevate, generando un segnale CARS più forte, aumentando così il rapporto segnale-rumore e/o la velocità di acquisizione. Il sistema è dotato di un microscopio a trasmissione fatto in casa per visualizzare cellule e tessuti ad alta velocità (<3 ms) con un ampio campo visivo (>800*800 µm^2). Utilizzando un innovativo algoritmo di post-elaborazione, forniamo mappe chimiche di alta qualità, distinguendo i principali composti chimici nelle cellule tumorali e identificando il cancro nelle fette di fegato di modelli murini, svelando il percorso per le applicazioni in contesti istopatologici.