An injectable composite gelatin-based photocurable hydrgogel for the treatment of osteochondral defects

Osteochondral (OC) injuries affect millions of people of all ages worldwide every year with a significant socio-economic impact. Many approaches are used to date but there is still no definitive therapy and an overall gold standard. Among the approaches that attempt to regenerate the osteochondral tissue in the appropriate way, minimally invasive injectable systems based on hydrogels have come to light in research. Among these, natural hy- drogels seem to be optimal candidates, but one of their main limitations is their lack of mechanical properties for load-bearing applications, as OC tissue. In the presented thesis it was demonstrated how to increase the compressive mechanical properties of a gelatin methacrylate (GelMA) network by using a filler based on dispersed fibers (DFs) made of a poly-(ε)-caprolactone (PCL) /GelMA blend so to obtain a GelMA+DFs composite. In order to produce DFs, electruspun random mesh (isotropic) and aligned mesh (anisotropic) were ultrasonicated. However, the procedure proved to be unreliable, probably due to the high plasticity of the PCL. Thus, a cryomicro-cutting approach was implemented in order to disperse fibers, resulting in microstructured DFs through a repeatable and controllable process where the cutting thickness was set to be 20 μm, allowing a control over the characteristic dimension of DFs. The GelMA+DFs composite specimens showed an adhesive interaction between DFs and GelMA network in addition to a tendency of DFs to to assume an entangled state, phys- ically intertwined like a web structure, which acts as a bridge between different spaced points within GelMA network. Porosity and pore dimensions were additionally not influ- enced by the presence of DFs. For the GelMA+DFs composite, elastic modulus values of 70.8 ± 5.8 kPa, max strength of 139.3 ± 10 kPa, max deformation at break 60.8 ± 2.6 % and toughness of 4 ± 0.2 J/m3 were achieved. The elastic modulus almost doubled GelMA value, giving to the composite a more stiff character. An injectability study, preceded by a rheological characterization, showed that it is pos- sible to inject homogeneously the GelMA solution at 30 and 37 ◦C by using different needle sizes (18, 20, 22G), showing maximal glide force value for the worst configuration up to 25N. At the same time it was not possible to inject uniformly for temperatures of 20 and 25 ◦C for all needle tested. A treshold value of injection force was suggested by EN ISO 7886 1:2018, in order to consider a substance injectable. The model adopted to predict the injectability of non-Newtonian fluids was found to be completely adequate to the experimental results from the injectability tests, showing an increasing discrepancy decreasing needle size and temperature. Composite GelMA + DFs filling may represent a new mini-invasive UV-photocurable way with high compressive mechanical performance to approach the key issues of clinical osteochondral repair with a soft injectable hydro- gel material. Some experimental tests are still ongoing, e.g., the injectability force, the swelling behavior and the sol fraction featuring the GelMA + DFs material.

I difetti osteocondrali (OD) affliggono milioni di persone ogni anno in tutto il mondo con un impatto socioeconomico notevole. Diversi approcci terapeutici sono stati impiegati ma ancora oggi non esiste un trattamento definitivo e soprattutto un gold standard terapeutico. Tra tutti gli approcci che tentano di rigenerare il tessuto nel modo appropriato, i sistemi iniettabili minimamente invasivi basati sugli idrogeli sono emersi in campo di ricerca. Tra questi, in particolare, gli idrogeli naturali si sono rivelati essere i potenziali candidati; tuttavia, uno dei loro limiti riguarda la perdita delle loro proprietà meccaniche in tessuti portanti, proprio come quello osteocondrale. Dunque, in questo studio sono stata affrontata la possibilità di aumentare le meccaniche di compressione di una rete di gelatina metacrilata (GelMA) attraverso un riempitivo basato su fibre disperse (DFs) costituite da una miscela di PCL/GelMA, al fine di ottenere un composito GelMA + DFs, di cui si è valutata la sua applicabilità come sistema iniettabile. Al fine di produrre le DFs, le maglie elettrospinnate in configurazione random (isotropiche) e allineate (anisotropiche) sono state prima ultrasonicate, portando a risultati non auspicati, rendendo la procedura fallimentare per lo scopo, probabilmente a causa dell’alta plasticità del PCL. In virtù di questo, è stata impiegata una tecnica di criomicrotaglio, che ha permesso di ottenere fibre disperse microstrutturate attraverso un processo ripetibile e controllabile, dove lo spessore di taglio è stato impostato a 20 µm, e questo ha consentito di avere un controllo sulla dimensione delle strutture a fibra. I campioni compositi GelMA+DFs hanno mostrato un'interazione adesiva tra le fibre disperse e la rete polimerica di GelMA, oltre che una tendenza delle fibre disperse ad assumere uno stato fisicamente intrecciato fungendo da ponte rinfornzante all’interno del network di GelMA senza alterarne significamente porosità e dimensione dei pori. Per il composito GelMA+DFs sono stati raggiunti valori di modulo elastico a compressione di 70,8 ± 5,8 kPa, resistenza massima di 139,3 ± 10 kPa, deformazione massima di 60,8 ± 2,6 % e tenacità di 4 ± 0,2 J/m2. Il modulo elastico ha quasi raddoppiato il suo valore, con differenze statisticamente significative rispetto alla sola rete di GelMA, conferendo in questo modo al composito un carattere più rigido senza renderlo però più fragile. Inoltre, uno studio di iniettabilità, preceduto da una caratterizzazione reologica, ha dimostrato che è possibile iniettare in modo omogeneo la soluzione di GelMA a 30 e 37 ˚C per le diverse dimensioni degli aghi utilizzati (18, 20, 22G), mostrando un valore massimo di forza di scorrimento per la configurazione peggiore fino a 25N. Allo stesso tempo, non è stato possibile iniettare uniformemente per temperature di 20 e 25 ˚C per tutti gli aghi testati. La norma EN ISO 7886 1:2018 suggerisce un valore soglia di forza di iniezione per considerare una sostanza iniettabile è di 10N. Test di iniettabilità sulla configurazione GelMA+DFs sono al momento in corso. Il modello adottato per prevedere l'iniettabilità dei fluidi non newtoniani è risultato non adeguatamente coerente rispetto ai risultati sperimentali dei test di iniettabilità, mostrando, in particolar modo, una discrepanza crescente al diminuire delle dimensioni dell'ago e della temperatura. Il riempimento composito GelMA + DFs può rappresentare un nuovo metodo mininvasivo, fotoreticolabile con UV e con elevate prestazioni meccaniche a compressione, pur essendo un idrogelo iniettabile. Alcuni test sperimentali sono ancora in corso, quali di iniettabilità, di swelling e di sol-fraction per il composito GelMA + DFs.