Synthesis and development of a phototunable MeHA-based 3D in vitro model of wound healing and fibrosis

Wound healing is a tightly regulated process in which extracellular matrix composition, mechanics and immune-stromal interactions evolve over time. When this regulation is disrupted, pathological fibrosis can develop, leading to impaired tissue function. While conventional two-dimensional in vitro models have provided important mechanistic insight, they poorly recapitulate the three-dimensional, dynamic nature of tissue repair. This thesis developed a mechanically tunable three-dimensional hydrogel-based in vitro platform based on methacrylated hyaluronic acid (MeHA), a biomaterial previously used in two-dimensional dynamic stiffening mechanobiology studies. To better support three-dimensional cell-matrix interactions and reduce confinement effects associated with dense hydrogel networks, MeHA was implemented as microgels assembling into a granular macroporous matrix and integrated into a microfluidic device compatible with standard imaging. MeHA synthesis was optimized to reduce batch-to-batch variability and functionalization was quantified by 1H NMR. Hydrogels with tunable stiffness were formed via Michael-type addition and further stiffened in situ via secondary photo crosslinking, enabling controlled stiffening to better reflect the evolving mechanics of wound healing and fibrosis. Rheological characterization confirmed that the platform spans stiffness ranges relevant to healthy and fibrotic dermal tissue and supports dynamic stiffening. Microgels were produced by mechanical fragmentation and co loaded with primary dermal fibroblasts into microfluidic devices, forming a granular matrix compatible with immunofluorescence staining and fluorescence imaging. Finally, experimental methods were established for future immune cell integration: primary monocytes were isolated from human whole blood and purity was validated by flow cytometry for subsequent macrophage differentiation and incorporation. Overall, this macroporous hydrogel system provides a reproducible platform to investigate how stiffness magnitude and mechanical history regulate cellular responses relevant to wound healing and fibrosis, with applicability beyond dermal models to other fibrotic tissues.

La guarigione delle ferite è un processo coordinato in cui composizione e proprietà meccaniche della matrice extracellulare (ECM), insieme alle interazioni tra cellule immunitarie e stromali, cambiano nel tempo. Quando la risoluzione fallisce, la riparazione può deviare verso la fibrosi, con perdita della funzione tissutale. Sebbene i modelli in vitro bidimensionali abbiano chiarito meccanismi importanti, non riproducono adeguatamente la natura tridimensionale e dinamica della riparazione tissutale. In questa tesi è stata sviluppata una piattaforma tridimensionale a base di idrogel, con proprietà meccaniche modulabili, basata su acido ialuronico metacrilato (MeHA), già impiegato in studi bidimensionali di meccanobiologia con irrigidimento dinamico. Per favorire interazioni cellula-matrice più rappresentative e ridurre il confinamento tipico di reti idrogel dense, il MeHA è stato realizzato come microgel assemblati in una matrice granulare macroporosa e integrati in un dispositivo microfluidico compatibile con imaging. La sintesi del MeHA è stata ottimizzata per ridurre la variabilità tra lotti e il grado di funzionalizzazione è stato quantificato tramite 1H NMR. Gli idrogel sono stati formati mediante addizione di tipo Michael e irrigiditi in situ tramite fotoreticolazione, ottenendo un incremento controllato della rigidità nel tempo. La caratterizzazione reologica ha confermato che la piattaforma copre intervalli di rigidità rilevanti per il derma sano e fibrotico. I microgel sono stati prodotti per frammentazione meccanica e co-caricati con fibroblasti dermici primari in dispositivi microfluidici compatibili con immunofluorescenza e imaging in fluorescenza. Infine, sono state poste le basi per l’integrazione della componente immunitaria: monociti primari sono stati isolati da sangue umano e la purezza è stata verificata mediante citofluorimetria per la successiva differenziazione in macrofagi da inserire nel sistema. Nel complesso, la piattaforma proposta è riproducibile e adatta a studiare come l’intensità ed evoluzione temporale della rigidità regolino le risposte cellulari rilevanti per guarigione e fibrosi, con potenziale estensione oltre al modello dermico.