Study of the electrical chemical manipulation of rat neuronal cultures in dual compartment devices on MEAs

Development of controlled in-vitro neural network models has long been a major challenge for neuroscience research. In-vitro models may provide good experimental access and better understanding of brain diseases and their treatment options, e.g. the motor pathways affected in Parkinson’s disease (PD). Although some motor symptoms of Parkinson’s disease are being treated with Deep Brain Stimulation (DBS) for more than a decade, progress in understanding the mode of action of DBS is slow. In-vivo access to the relevant neuronal networks is severely restricted, and organotypic brain slices are unable to capture enough of the three-dimensional pathways that are the substrate of PD’s motor symptoms. On the other hand, in-vitro neural network models are promising tools for gaining insight into many chronic brain diseases and their treatment. In an attempt to build an in-vitro neural network model, the DBS group at Philips Research led by Prof. Michel Decré has demonstrated a dual compartment neurofluidic system with inter-connected micro-channels to connect neurons from their respective compartments on a planar Micro-Electrodes Array (MEA) (1). Cell culture protocols of dissociated rat cortical neurons in such devices, axonal growth through micro-channels, and analyses of functional connectivity between compartments through electrophysiological studies were demonstrated in their earlier work (2). In this present work, electrical and chemical neuromodulation of cells in the dual-compartment device is demonstrated. With the objective to further demonstrate functional connectivity across the micro-channels a detailed study on the influence of electrical / chemical neuromodulation is presented. In the case of electrical stimulation, spreading of electrical artifacts in the cell culture medium between the compartments is clearly evident in our earlier studies. Various configurations of stimulating electrodes and their influence on artifact spreading in the compartments are demonstrated. With the final goal of studying different populations of neurons i.e. cortical and thalamic, a more specific stimulation focusing on a smaller area which affects only one compartment was investigated. A bipolar configuration used together with 4 external grounded sites connected to the neural basal medium was chosen as the most optimal configuration and has been studied in this report. The effects of this new configuration on cortico-cortico devices were also explored by the evoked response elicited in the cells. It is shown that this new configuration is focused on a smaller area than the unipolar stimulation at the same frequency and amplitude reported in literature (3). In further confirm the earlier work on fluidic isolation between the compartments, an extensive study on the influence of medium diffusion from one compartment to the other compartment with time was analyzed with spectrophotometric technique and the results presented in this work. Additionally, the influence of synaptic blocker in one compartment and the influence on the network propagation when Tetrodotoxin (TTX) was added in compartment with electrical stimulation are presented.

Lo sviluppo di modelli di reti neurali in ambienti controllati in-vitro e’ stata a lungo una delle maggiori sfide nel campo delle ricerche neuroscientifiche. Modelli in-vitro forniscono un buon accesso sperimentale per una migliore comprensione delle malattie neurodegenerative e del loro trattamento, quali ad esempio le vie motorie affette dal morbo di Parkinson. Nonostante alcuni disagi motori nel morbo di Parkinson siano stati trattati per più di una decade attraverso la Deep Brain Stimulation (DBS), i progressi nella comprensione delle modalità di azione della DBS sono lenti. L’accesso in-vivo alle reti neurali coinvolte dallo stesso morbo è duramente compromesso, mentre le slices cerebrali organotipiche sono incapaci di catturare a sufficienza la tridimensionalità delle vie neurali coinvolte nel substrato dei sintomi motori nel Parkinson. D’altro canto, i modelli di reti neurali in-vitro sono strumenti molto promettenti per l’indagine di diverse malattie cerebrali croniche e del loro trattamento. Con l’intento di costruire un modello di rete neurale invitro, il DBS group in Philips Research guidato dal prof. Michel Decré ha dimostrato che un sistema neurofluidico a doppio compartimento con micro-canali interconnettenti è in grado di porre in comunicazione neuroni dalle loro rispettive camere su una matrice planare di microelettrodi (MEA) (1). Protocolli di coltura di cellule corticali di ratto, crescita assonale nei micro-canali e analisi della connettività funzionale tra compartimenti attraverso studi elettrofisiologici sono stati dimostrati in uno studio precedente all’interno dello stesso gruppo (2). Una volta raggiunta una certa confidenza negli studi delle cellule corticali di ratto, si rivela interessante l’applicazione degli stessi studi su diverse popolazioni di neuroni. Nello specifico, prendendo ispirazione dalle vie neuronali coinvolte nei meccanismi di generazione del morbo di Parkinson, ci si prefigge lo scopo di analizzare le dinamiche delle comunicazioni sinaptiche tra popolazioni diverse di cellule quali corticali, talamiche, il corpo striato e i segmenti interni del globus pallidus (4). Perciò all’interno di questo progetto si inizia l’estrazione di cellule provenienti dal talamo. Individuate all’interno degli atlanti del cervello di ratto embrionale al 18° giorno di gestazione, si è cercato di eseguire la raccolta di tali neuroni dalle parti interessate. Questo, permetterà uno studio delle dinamiche oltre che delle sole cellule talamiche, anche un ipotetico collegamento con cellule corticali nello stesso piatto. Andando ad investigare il tipo di stimolazione che si può eseguire su cellule talamiche, è inoltre possibile vederne gli effetti su cellule corticali per un più approfondito studio delle tecniche DBS. Mentre, molti studi di stimolazione elettrica neuronale corticale sono stati effettuati in-vivo e in-vitro e lo stato attuale della ricerca su questo tipo di colture corticali ha raggiunto una comprensione tale per cui i parametri di stimolazione elettrica sono già stati definiti (3), interessanti sviluppi sono possibili. Nel presente lavoro, la neuro modulazione elettrica e chimica di cellule neurali è spiegata. Con l’obiettivo finale di dimostrare ulteriormente la connettività funzionale attraverso i micro-canali, uno studio dettagliato sull’influenza della neuro modulazione elettrica / chimica è presentato. In particolare si vuole cercare di determinare l’effetto di una eccitazione di una delle popolazioni sull’altro compartimento, e determinare così non solo la connessione in termini di correlazione tra i due compartimenti, ma anche e soprattutto il tipo di influenza che una popolazione di neuroni ha su un’altra, come ad esempio potrebbe essere tra talamiche e corticali. Prima di arrivare ad uno studio di questo tipo, è necessario osservare gli effetti di una stimolazione elettrica e/o chimica sui MEA ed eventualmente sui dispositivi applicatisi. Nel caso di stimolazione elettrica, la diffusione di artefatti elettrici e di un certo tipo di risposta neuronale evocata nei due compartimenti è evidente nei nostri studi precedenti. Con lo scopo finale di studiare diverse popolazioni di neuroni, quali corticali e talamiche, una più specifica stimolazione focalizzata su una superficie minore in grado di influenzare solo uno dei compartimenti è stata studiata in questo progetto. Ciò viene utile quando, come è stato osservato, il tipo di stimolazione fornito alle colture corticali non si adatta alle colture subcorticali / talamiche che sono state estratte e che oltremodo ne danneggia la specifica attività spontanea. In conseguenza di ciò, varie configurazioni di elettrodi stimolati o posti a massa e della loro influenza sulla diffusione degli artefatti tra i compartimenti sono state sperimentate. Un nuovo tipo di configurazione bipolare diversa dalla vecchia unipolare utilizzata congiuntamente a 4 punti di massa distanti dalla stimolazione collegati al medium basale neurale è stata scelta come configurazione ottimale ed i suoi effetti sono stati documentati in questo report. L’effetto di questa nuova configurazione su dispositivi con cellule corticali nei due compartimenti è stato esplorato attraverso la risposta evocata neuronale. In particolare, è mostrato che questa nuova configurazione risulta essere molto più focalizzata rispetto alla stimolazione monopolare data alla stessa frequenza e ampiezza che è stata ampiamente utilizzata in letteratura. I risultati presentati in questo report documentano che una stimolazione con configurazione bipolare risulta focalizzata nell’area appena intorno gli elettrodi stimolati. Tuttavia, si potrebbe obiettare che nel corso della stessa stimolazione bipolare, gli elettrodi che non mostrano nessuna risposta potrebbero essere non attivi oppure poco responsitivi. Per questo, sono stati effettuati alcuni esperimenti in cui unitamente ad una stimolazione bipolare si è effettuare lo stesso giorno dell’esperimento oppure qualche giorno dopo, una stimolazione unipolare che ha dimostrato ancora una volta una propagazione della corrente elettrica su tutto il piatto. Per quanto riguarda le stimolazioni di tipo chimico, è necessario documentare un isolamento chimico inter-compartmentale, per far sì che l’effetto di un determinato componente influisca solo sul comportamento di una delle due camere. In questo progetto si è accertata una ulteriore conferma del precedente studio sull’isolamento fluidico tra compartimenti attraverso uno studio estensivo sull’influenza della diffusione di medium da un compartimento all’altro rispetto al tempo analizzando le soluzioni dei due compartimenti con tecniche spettrofotometriche. I risultati sono presentati in questo lavoro. Un secondo approccio è stato anche utilizzato basato sull’influenza sull’attività spontanea dei neuroni di alcuni composti conosciuti come la Tetrodotossina (TTX) oppure un composto in grado di bloccare reversibilmente le connessioni sinaptiche tra neuroni. In particolare si è dimostrato in questo progetto e in studi precedenti (1) che l’influenza dei due composti chimici applicati ad una delle due camere, non influenza l’attività sinaptica dell’altro compartimento. Oltre a ciò, dato il particolare effetto del secondo composto (il Bloccatore di Sinapsi) interessanti studi sull’attività genuina delle cellule può essere studiato. Infatti, mentre normalmente le colture corticali sono pesantemente influenzate da fenomeni di bursts, interrompendo la comunicazione tra cellule la sincronia sparisce portando i neuroni a perdere la precedente attività di burst in favore di più isolate attività di spiking. Nei nostri studi si sono verificati anche episodi di inibizione tra neuroni, per cui nel momento di esposizione a TTX o Bloccatore Sinaptico di una popolazione, alcuni elettrodi del compartimento adiacente hanno registrato un aumento di attività. In più, date le caratteristiche di reversibilità della tossina TTX, è stata possibile eseguire una prova della focalizzazione della stimolazione elettrica fornendo al contempo una inibizione di tipo chimico associato ad una stimolazione di tipo elettrico. Nel caso in cui si registri una risposta evocata alla stimolazione elettrica nel compartimento non chimicamente alterato, la propagazione elettrica si verifica; d’altra parte nel caso in cui precedentemente si registra una risposta evocata e successivamente attraverso l’uso di TTX si dimostra la non presenza della stessa risposta nei due compartimenti, significa che la stimolazione rimane focalizzata in uno dei compartimenti e che una possibile propagazione sinaptica avviene. Altri esperimenti con composti chimici sono stati effettuati. In particolare si è cercato un composto con effetto stimolante su popolazioni talamiche. Il composto che è stato testato in questo progetto è l’acetilcolina. Mentre da una parte la letteratura si dimostra sorpassata e poco applicabile a colture dissociate di cellule neuronali di ratto, i nostri esperimenti non hanno evidenziato nessuna particolare caratteristica comune, per cui non è stato possibile trarne utili conclusioni. Si raccomanda perciò uno studio più approfondito sia dell’effetto dell’acetilcolina sia alla ricerca di un composto in grado di eccitare le cellule neuronali. In conclusione, gli studi sulle cellule neuronali basati sui MEA risultano essere interessanti e promettenti. Ulteriori progetti che stanno interessando l’argomento riguardano lo sviluppo di MEA 3D capaci di catturare la tridimensionalità di colture di cellule neuronali sparse, ma anche di slices e di intere sezioni di cervello. Caratteristiche di tridimensionalità risulterebbero essere di particolare aiuto non solo in fase di registrazione, ma anche di stimolazione fornendo così una più appropriata localizzazione. Su questa linea, alcuni gruppi di ricerca si stanno inoltre interessando alla Brain Machine Interface in senso largo, in cui cercano di collegare cellule neuronali su MEA a dispositivi robotici in grado di interagire con la realtà, fornendo così un “corpo” al cervello simulato dalle colture neuronali.