Influence of hydration on mechanical properties of bone measured by nanoindentation

Bone is a mineralized tissue that serves a wide range of structural, metabolic and biological function, including supporting the body, protecting the vital organs, allowing movements, storing bone marrow and calcium. Bone shows complex hierarchical organization from the nanometer to the macroscopic scale. The hierarchical structure provides maximum strength with a minimum of material, and is known to adapt to the biological function of the bone by changing the arrangement of the components at different sizes. The complexity of bone's properties critically depends on the interplay between different structural levels: from the molecular/nanoscale interaction between crystallites of calcium phosphate and an organic framework, through the micrometer-scale assembly of collagen fibrils, to the millimeter-level organization of lamellar bone. Bone contains three main phase: mineral, collagen and water, tightly interconnected at the nanoscale. The mineral phase controls the bone stiffness, whereas the collagen contributes to its strength and toughness. Bound and unbound water contributes to elasticity and ductility. The mechanical characterization of bone is of the highest importance in clinical medicine and the field of biomaterials. However, there is a paucity of information regarding the role of tissue mechanic in disease progression, tissue repair, and remodeling mechanisms associated with medical treatments. Nanoindentation has been widely used as a means to measure the micro-mechanical properties of bone since it allows testing small volumes and excludes the effects of large-scale porosity. Moreover, it has become an increasingly popular technique to study a wide range of viscoelastic materials such as biological tissue and polymers. Because of the viscoelastic nature of collagen fibers in the bone matrix, bone itself has remarkable viscoelasticity, which has been correlated also with hydration state and mineral content. The most readily observed effect of viscoelasticity on indentation is creep, or a sinking of the tip into the sample under a constant load. The creep depth as a function of time can be fit to rheological models in order to determine parameters that describe the viscoelastic behavior. In addition, many commercial nanoindenters have a dynamic testing option, where sinusoidal loads can be applied to measure storage and loss moduli and allowing direct measurements of time-dependent properties. All nanoindentation experiments were carried out with an Ultra Nano Hardness Tester (CSM Instruments SA, Switzerland) with ultra low thermal drift, equipped with acoustic damping enclosure so as to minimize instabilities due to the ambient background noise. At any scale, the mechanical response of bone depends heavily on extrinsic factors that include preparation techniques, hydration state, and mechanical test type and tip shape. Bone specimens were obtained from the midshaft of one bovine femur ($24$ months old) without bone disease. In order to keep the samples in as close to physiological conditions as possible, they were kept hydrated throughout the preparation steps. In fact, the water content of bone ($10\div 20\%$) plays an important role in determining its mechanical properties. All bone specimens were embedded in polymethylmethacrylate, which didn't reasonably infiltrated the bone tissue. Moreover, the sample preparation was performed without chemicals for cleaning and dehydration. In this way the mechanical properties of the microstructural features were kept as natural as possible. The sample surface was smoothed with an ultramiller system, while the polishing was avoided because it was found to introduce cracks in the bone surface. After milling, the specimens were not freeze again and they were not tested after being absorbed in saline solution for more than $15$ hours. Axial and transverse specimens were cut from the bovine femur, but an optimized preparation protocol could not be found for the latter ones. It was therefore decided to focus on axial specimens. The dry and the wet specimens followed the same preparation procedure, but the former ones were then left air-drying in room conditions for $48$ hours before testing. For hydrated nanoindentation tests, a fluid cell was used to keep the specimen submerged in a saline solution. However, specialized tips with long shafts were required and data acquisition was complicated by meniscus forces acting on the indenter. Two different indenter geometries were employed in the present study: Berkovich and spherical. Berkovich tips are "sharp" and cause significant plastic deformation at the onset of indentation due to the stress concentration near the material's surface. The spherical indenters are used to minimize plastic deformation and stress concentrations and avoid damaging the sample. Two kinds of configurations were tested: dry and wet indentations. Four sets of experiments have been carried out for each configuration and the load-displacement curves have been acquired in load control mode. The first protocol employed a trapezoidal load history with a $\SI{30}{s}$ holding time at each peak load. Three different penetration depths have been explored: $1000$, $1500$ and $\SI{2000}{nm}$ with Berkovich tip, and $500$, $750$ and $\SI{1000}{nm}$ with spherical tip. In the five step procedure (protocol n\textdegree 2), the indenter tip was loaded at each mean peak load calculated in the first set of experiments. A first $\SI{30}{s}$ holding phase at maximum load was followed by a second holding phase at $10\%$ of this load. The third set of experiment used the DMA mode at $5$, $25$ and $\SI{50}{Hz}$. The peak load was fixed to $\SI{50000}{\micro N}$ for the Berkovich tip and to $\SI{80000}{\micro N}$ for the spherical tip, and the sinus amplitude was set to the $10\%$ of the peak load. The fourth protocol is called progressive multi-cycle because the indenter tip in incrementally loaded and unloaded into the bone over a preselected ($7$) number of intervals. At each maximum and minimum load level, a $\SI{30}{s}$ holding phase was included. All indentation locations were selected within plexiform regions and with a $\SI{50000}{\micro\metre}$ spacing using instrument's internal microscope. From analysis of the indentation load-displacement curves, values of indentation modulus and hardness of the material can be derived using well-established equations based on elastic contact theory. Following the method of Oliver and Pharr \cite{Oliver1992}, the $60\%$ of the unloading curve was fitted with Python to a power function, which was then differentiated and evaluated at maximum displacement to determine the stiffness S. The contact area A is function of the contact depth and was determined through the use of an empirically derived indenter area function. The hardness $H_{IT}$ and the reduced modulus $E_r$, follow from: \begin{equation*} H_{IT} = \frac{P_{max}}{A} \end{equation*} and \begin{equation*} E_r = \frac{\sqrt{\pi}}{2\beta}\frac{S}{\sqrt{A}} \end{equation*} where $\beta$ is an indenter geometry-dependent constant. $E_r$ is the result of combined elastic displacement of tested surface and indenter, so the indentation modulus $E_{IT}$ follows from: \begin{equation*} \frac{1}{E_r} = \frac{1}{E_{IT}} + \frac{1 - \nu _i^2}{E_i} \end{equation*} where $E_i$ ($= \SI{1141}{GPa}$) and $\nu _i$ (= $0{,}07$) are the Young's modulus and the Poisson's ratio of the diamond indenter. Indentation modulus and hardness were calculated in experimental set\textdegree 1, 2 and 4. The ratio between the elastic work and the total work was calculated from each $P$-$h$ curve of those experimental sets. In the first set of experiments, two different analysis have been used to examine indentation with a standard linear solid model for a Berkovich and a spherical indenter. The viscoelastic solution derived by Vandamme and Ulm \cite{Vandamme2006} was employed for the Berkovich indenter, which is assimilated to a conical indenter of equivalent cone angle $\theta = \ang{70{,}32}$. Whereas, the indentation of bone by a spherical tip was analyzed using the solution derived by Cheng et al. \cite{Cheng2005}. The input parameters were the instantaneous elastic modulus $E_1$, which was assumed equal to the Young's modulus of the material, and the two Poisson's ratio $\nu _1$ and $\nu _2$, which were assumed equal to $0{,}3$ and $0{,}5$ respectively. The delayed elastic parameters, $E_2$ and $\eta$, were identified by fitting the holding response of the indentation test to the viscoelastic solutions mentioned above. In experimental set n\textdegree 2 and 4, creep and recovery distances were measured as the change in depth of the indenter during the holding times at maximum and minimum load respectively. In case of DMA measurements, the dynamic mechanical analysis allows for a continuous acquisition of hardness, indentation modulus, storage and loss modulus data as a function of indentation depth. The sample surface roughness after the final preparation protocol was checked with an Atomic Force Microscope. Moreover, after experiments, each bone sample surface was observed with help of optical microscopes at 5x and 100x magnification. Mean and standard deviations of each parameter calculated have been plotted as a function of the penetration depth. The results of the first two experimental set were compared using two-way ANOVA performed with R. The penetration depths of $1000$-$\SI{2000}{nm}$ explored with the Berkovich tip correspond to a contact diameter of $\approx 6$-$\SI{11}{\micro\metre}$, while the penetration depths of $500$-$\SI{1000}{nm}$ explored with the spherical tip correspond to a contact diameter of $\approx 14$-$\SI{20}{\micro\metre}$. Thus, in the present study, the length scale probed is comparable with the size of one or more lamellae in a osteon (an average lamellar layer is between $3$ and $\SI{7}{\micro\metre}$), but the material properties reported at these specific penetration depths reflect the average material response from the initial point of contact down to the specific depth reported. Penetration depths lower than $\approx \SI{500}{nm}$ were not explored due to the great influence of the surface roughness on the properties measured. A constant value of $E_{IT}$ with depth is expected for homogeneous elastic solid, but not for bone which has a intricate hierarchical structure. Significant differences of $E_{IT}$ in dry and wet conditions were found in all the experimental set. For the Berkovich tip, $E_{IT}$ ranged from $22$ to $\SI{26}{GPa}$ in dry conditions, and from $15$ to $\SI{20}{GPa}$ in wet conditions. The percentage difference between the results in dry and wet conditions was equal to $\approx 36\%$ at low penetration depth and it fell to $\approx 20\%$ while increasing the depth. For the spherical tip, $E_{IT}$ showed significantly lower values, it ranged from $13$ to $\SI{16}{GPa}$ in dry conditions, and from $9$ to $\SI{14}{GPa}$ in wet conditions. The percentage difference showed the same trend as in the previous case. At low penetration depth $E_{IT}$ of the wet bone was $\approx 30\%$ lower than the dry conditions, but it was $\approx 6\%$ higher at $\SI{1000}{nm}$ depth. The change in the indentation modulus between wet and dry samples can be explained by the replacement of the weak hydrogen bonds with stronger inter-peptide bonds during dehydration. Moreover, the fact that the wet measurements presented lower force than their dry counter parts to reach the same penetration depth suggests a higher compliance for the former condition. An higher indentation modulus and hardness might also be partially explained by a greater degree of mineralization, which provides a rigid scaffold and prevents the collagen fibrils from contracting. For bone sample in liquid environment, mineral may be lost from the near-surface region. Nanoindentation is a surface-sensitive technique and this demineralization would result in a reduced elastic modulus and a more viscoelastic response from this region. Hardness values demonstrated trends comparable to indentation modulus in each test protocol. For both the indenter tips, the difference between dry and wet condition decreased from $62\%$ to $24\%$ while increasing the penetration depth. For the Berkovich tip, the mean $H_{IT}$ values were found to be between $820$ and $\SI{1000}{MPa}$ in dry conditions, and between $380$ and $\SI{670}{MPa}$ in wet conditions. For the spherical tip, the mean $H_{IT}$ values ranged from $230$ to $\SI{350}{MPa}$ in dry conditions, and between $90$ to $\SI{230}{MPa}$ in wet conditions. The $E_{IT}$/$H_{IT}$ ratio is a quantitative measure of the relationship between a material's plastic and elastic deformation behavior. At higher penetration depths greater permanent deformations were observed, even if the spherical indenter produced smaller plastic deformations than the Berkovich tip. The ratio $E_{IT}$/$H_{IT}$ was higher in dry state than in wet conditions, and this means the the wet bone was more affected by viscoelastic recovery. Concerning the results for the viscoelastic analytical solutions, the hydration condition was the highly significant factor for all the parameters calculated. The elastic moduli and the viscosity were found to be higher in dry conditions, and the instantaneous elastic modulus was greater than the corresponding delayed elastic modulus. These results reflected a more significant time-dependent behavior of wet bone. However, all the differences reduced while increasing the penetration depth, suggesting a gain of plastic effects. In particular, the viscosity in wet conditions was found to be very small, thus the material response was mainly elastic. Unfortunately, it hasn't been possible to analyze the storage and loss moduli from the DMA mode due to an internal error of the model implemented in the software. Negative values of loss moduli were provided at each frequency and penetration depth, and this has no physical meaning. The ratio $W_{el}/W_{tot}$ is a measure of the reversible elastic contribution to the total work. This ratio ranged from $44$ to $50\%$ for the spherical indenter tip, and from $25$ to $29\%$ for the Berkovich tip. The results for the spherical tip was significantly influenced by the penetration depth, but not by the hydration condition. At higher contact depth, the spherical indent exhibited more plastic deformation. On the contrary, the hydration condition was found to be an highly significant factor for the Berkovich tip, and wet bone exhibited a ratio $W_{el}/W_{tot}$ $10\%$ higher than in dry conditions. Creep and recovery are forms of time-dependent viscoelastic deformation. These factor were seen to be highly influenced by both the penetration depth and the hydration state. In dry conditions the recovery distance was lower than the corresponding creep distance at each indentation depth, while it was the opposite in wet conditions. This results agree with the greater viscoelastic behavior in wet bone. It is suggested that nanoindentation in physiological conditions gives a better estimate of the mechanical properties of the microstructural components of bone in vivo rather than nanoindentation under conventional conditions. This study investigated the effects of hydration on bone's properties using two different indenter shapes. The importance of bone viscoelasticity in physiological condition has been pointed out and it could help to further improve the understanding of the mechanical properties of bone.

Il tessuto osso \'e un tessuto connettivo mineralizzato con importanti funzioni strutturali, metaboliche e biologiche, tra cui sostenere del corpo, proteggere organi vitali, permettere il movimento e fornire una riserva di midollo osseo e di calcio. L'osso possiede una complessa organizzazione gerarchica dal livello della nanoscala fino alla macroscala. Tale struttura gerarchica fornisce la massima resistenza con l'impiego della minore quantit\'a possibile di materiale ed \'e inoltre in grado di adattarsi continuamente alla funzione biologica richiesta variando la disposizione dei suoi costituenti ad ogni livello di scala. La complessit\'a delle propriet\'a ossee \'e strettamente legata alle influenze reciproche tra i vari livelli di scala: dalla nanoscala con le interazioni molecolari tra i cristalli di fosfato di calcio e le componenti organiche, attraverso l'assemblaggio delle fibrille di collagene alla scala micrometrica, fino all'organizzazione in osso lamellare a livello millimetrico. Il tessuto osseo \'e composto da tre costituenti essenziali strettamente interconnessi alla nanoscala: i minerali, il collagene e l'acqua. La fase minerale \'e responsabile della rigidezza dell'osso, il collagene contribuisce in modo significativo alla sua tenacit\'a e resistenza, mentre l'acqua fornisce elasticit\'a e duttilit\'a. La caratterizzazione meccanica dell'osso \'e di estrema importanza per la medicina clinica e per il campo dei biomateriali. C'\'e, tuttavia, un'insufficienza di informazioni riguardanti il ruolo meccanico del tessuto osseo nello sviluppo di patologie, nel riparo tessutale, e nei meccanismi di rimodellamento associati con i trattamenti medici. La tecnica della nanoindentazione \'e stata largamente utilizzata come strumento per stimare le propriet\'a meccaniche dell'osso, tale tecnica permette, infatti, di investigare ridotti volumi di materiale, escludendo cos\'i gli effetti della porosit\'a (ad eccezione di quella nanometrica). La nanoindentazione sta inoltre diventando sempre pi\'u popolare per studiare numerosi materiali viscoelastici come i polimeri e vari tessuti biologici. L'osso possiede notevoli propriet\'a viscoelastiche che sono state associate sia alla natura viscoelastica delle fibre di collagene presenti nella matrice ossea, sia al contenuto di minerali e all'idratazione. Il pi\'u evidente effetto associato alla viscoelasticit\'a \'e il creep, che si manifesta come un continuo affondamento della punta dell'indentatore quando le viene applicato un carico costante. L'andamento della penetrazione in funzione del tempo pu\'o essere interpolato con l'utilizzo di modelli reologici per estrarne parametri che descrivano il comportamento viscoelastico. Numerosi nanoindentatori sono inoltre in grado di effettuare test dinamici applicando un carico sinusoidale e fornendo direttamente i valori di "storage" e "loss" moduli. Nel presente lavoro, tutte le prove di nanoindentazione sono state effettuate utilizzando un Ultra Nanoindentatore (CSM Instruments SA, Svizzera), con elevata stabilit\'a termica ed equipaggiato con una cabina d'isolamento acustico per minimizzare ogni instabilit\'a dovuta al rumore ambientale. Ad ogni livello di scala osservata, la risposta meccanica dell'osso \'e fortemente influenzata da una serie di fattori tra cui: le tecniche di preparazione dei campioni, il livello di idratazione, il protocollo di prova e la geometria della punta dell'indentatore. I campioni ossei utilizzati nel presente lavoro sono stati ottenuti dal tessuto osseo corticale della diafisi femorale proveniente da un bovino sano di 24 mesi. Per discostarsi il meno possibile dalle condizioni fisiologiche, i campioni sono stati mantenuti idratati attraverso tutti i passaggi previsti dal protocollo di preparazione. Il contenuto d'acqua del tessuto osseo ($10\pm 20\%$) svolge un ruolo rilevante nel determinarne le propriet\'a meccaniche. I campioni ossei sono stati incastonati in polimetilmetacrilato ad elevata viscosit\'a, che quindi non si \'e significativamente infiltrato nel tessuto osseo. La preparazione dei campioni \'e stata inoltre effettuata senza l'utilizzo di prodotti chimici, cosicch\'e tutte le caratteristiche della microstruttura sono state mantenute nello stato pi\'u naturale possibile. La superficie dei campioni \'e stata lisciata con un sistema di ultrafresatura. La procedura di lucidatura \'e stata evitata perch\'e causa della formazione di micro-fratture nella superficie ossea. Dopo essere stati fresati, i campioni non sono stati congelati nuovamente, ma sono stati immediatamente testati. Nessuna prova di nanoindentazione \'e stata effettuata su campioni lasciati immersi nella soluzione salina per pi\'u di $15$ ore. Dal femore bovino sono stati tagliati sia campioni assiali che traversali, tuttavia per questi ultimi non \'e stato possibile determinare un protocollo di preparazione ottimale. Tutte le analisi si sono quindi concentrate sui campioni assiali. I campioni idratati e secchi sono stati sottoposti alla stessa procedura di preparazione, al termine della quale i secondi sono stati lasciati asciugare a temperatura ambiente per $48$ ore. Per effettuare prove di nanoindentazione sui campioni idratati, una cella liquida \'e stata utilizzata in modo da mantenere i campioni sempre immersi nella soluzione salina. Specifiche punte con supporti pi\'u lunghi sono richieste e l'acquisizione dei dati viene complicata dalla presenza di un menisco che da origine a forze agenti sull'indentatore. Due punte con differenti geometrie sono state impiegate: l'indentatore di Berkovich e l'indentatore sferico. Il primo tipo di indentatore \'e appuntito e provoca importanti deformazioni plastiche anche a basso carico a causa di una concentrazione di sforzi. Il nanoindentatore sferico, invece, minimizza le deformazioni plastiche e la concentrazione di sforzi, evitando cos\'i ogni di danneggiare il campione. Le prove sperimentali sono state effettuate in due diverse configurazioni: in ambiente asciutto e in presenza di liquido. Quattro diverse serie sperimentali sono state realizzate per ogni configurazione e tutte le curve carico-penetrazione ($P$-$h$) sono state ricavate in controllo di carico. Il primo protocollo consisteva in una curva di carico trapezoidale con un tempo di hold di $\SI{30}{s}$. Tre diverse profondit\'a sono state esplorate per ogni indentatore: $1000$, $1500$ e $\SI{2000}{nm}$ per la punta di Berkovich, e $500$, $750$ e $\SI{1000}{nm}$ per quella sferica. Il secondo protocollo \'e chiamato "a cinque step". L'indentatore viene caricato fino ad un carico massimo calcolato come media dalla prima serie sperimentale, dopo un tempo di hold di $\SI{30}{s}$ viene scaricato fino al $10\%$ del carico massimo, a cui segue un ulteriore periodo di hold. Nella terza serie sperimentale viene utilizzata la modalit\'a DMA del nanoindentatore con tre diverse frequenze: $5$, $25$ e $\SI{50}{Hz}$. Il carico massimo \'e stato fissato a $\SI{50000}{\micro N}$ per la punta Berkovich e $\SI{80000}{\micro N}$ per quella sferica, mentre l'ampiezza dell'oscillazione \'e stata impostata al $10\%$ del carico massimo. L'ultimo protocollo ha previsto l'applicazione di carichi progressivamente crescenti nello stesso sito d'indentazione per $7$ diversi livelli di forza. Un periodo di hold di $\SI{30}{s}$ \'e stato applicato sia ai massimi carichi, sia ai minimi. Tutti i punti da sottoporre a nanoindentazione sono stati accuratamente selezionati all'interno delle regioni plessiformi del tessuto osseo attraverso il microscopio ottico montato sull'Ultra Nanoindentatore. Tra le diverse posizioni scelte \'e stata lasciata una distanza minima di $\SI{50000}{\micro\metre}$. I valori del modulo di indentazione e della durezza sono stati calcolati dalle curve $P$-$h$ attraverso un'equazione ampiamente utilizzata basata sulla teoria di Hertz e riguardante il contatto dei solidi elastici \cite{Hertz1896}. Applicando il metodo proposto da Oliver e Pharr \cite{Oliver1992}, il $60\%$ della porzione di scarico della curva $P$-$h$ \'e stata interpolata attraverso Python con una funzione di potenza, questa \'e poi stata differenziata e risolta nel punto di massima penetrazione per determinare la rigidezza $S$. L'area di contatto \'e invece funzione della profondit\'a ed \'e stata valutata attraverso l'utilizzo di funzioni derivate empiricamente per ogni geometria dell'indentatore. La durezza $H$ e il modulo ridotto $E_r$ sono stati calcolati dalle seguenti formule: \begin{equation*} H = \frac{P_{max}}{A} \end{equation*} e \begin{equation*} E_r = \frac{\sqrt{\pi}}{2\beta}\frac{S}{\sqrt{A}} \end{equation*} in cui $\beta$ \'e una costante dipendente dalla geometria dell'indentatore. $E_r$ contiene informazioni riguardanti non solo la deformazione del campione, ma anche quella dell'indentatore, quindi il modulo di indentazione $E_{IT}$ pu\'o essere ricavato da: \begin{equation*} \frac{1}{E_r} = \frac{1}{E_{IT}} + \frac{1 - \nu _i^2}{E_i} \end{equation*} in cui $E_i$ ($= \SI{1141}{GPa}$) e $\nu _i$ (= $0{,}07$) sono il modulo di Young e il modulo di Poisson della punta del nanoindentatore costituita di diamante. Il modulo di Young e la durezza sono calcolati seguendo questa procedura nelle serie sperimentali n\textdegree 1, 2 e 4. Nelle stesse serie, il rapporto tra il lavoro elastico e il lavoro totale \'e calcolato da integrazioni dell'area sottesa alle curve $P$-$h$. Nel primo protocollo sperimentale sono state inoltre implementate due diverse analisi per studiare le indentazioni attraverso il modello reologico del solido lineare standard (SLS). La soluzione viscoelastica studiata da Vandamme e Ulm \cite{Vandamme2006} \'e stata applicata per le indentazioni con la punta Berkovich, questa pu\'o essere infatti assimilata ad una punta conica con angolo di cono $\theta = \ang{70{,}32}$. La soluzione viscoelastica di Cheng \cite{Cheng2005} \'e stata invece utilizzata per studiare le indentazioni effettuate con la punta sferica. Per ambedue i modelli i parametri di input sono stati il modulo elastico istantaneo $E_1$, assunto uguale al modulo di Young, e i due moduli di Poisson $\nu _1$ e $\nu _2$, assunti pari rispettivamente a $0{,}3$ e $0{,}5$. I parametri che esprimono il ritardo del comportamento, $E_2$ e $\eta$, sono stati calcolati attraverso il fitting della risposta del materiale durante il tempo di hold. Nei protocolli sperimentali 2 e 3, creep e recovery sono stati calcolati come la variazione di penetrazione dell'indentatore durante i periodi di hold ai carichi massimi e minimi rispettivamente. Per quanto riguarda le misure effettuate in modalit\'a DMA, l'analisi in modo dinamico restituisce la durezza, il modulo elastico, e "storage" e "loss" moduli in funzione della profondit\'a. La rugosit\'a superficiale dei campioni \'e stata controllata dopo la procedura di preparazione attraverso un microscopio a forza atomica. Due microscopi ottici con ingrandimenti 5x e 100x sono stati invece utilizzati al termine di ogni serie di prove per osservare le regioni indentate e la condizione della superficie del campione. Il valor medio e la deviazione standard di tutti i valori calcolati sono stati rappresentati in grafici in funzione della profondit\'a di penetrazione. Le analisi statistiche sono state effettuate in R utilizzando la funzione per l'analisi della varianza a due vie (ANOVA a due vie). Le profondit\'a $1000$-$\SI{2000}{nm}$ esplorate con la punta Berkovich, corrispondono a contatti di diametro $\approx 6$-$\SI{11}{\micro\metre}$, mentre per quanto riguarda la punta sferica, le profondit\'a $500$-$\SI{1000}{nm}$ corrispondono a contatti di diametro $\approx 14$-$\SI{20}{\micro\metre}$. Di conseguenza, nel presente lavoro le dimensioni delle aree di contatto sono confrontabili alla dimensione di una o pi\'u lamelle (il loro spessore medio \'e infatti compreso tra $3$ e $\SI{7}{\micro\metre}$), ma le propriet\'a del materiale ad una specifica profondit\'a corrispondono a una risposta media del materiale dal punto d'inizio del contatto, fino alla profondit\'a massima. Non sono state effettuate prove a profondit\'a inferiori a circa $\SI{500}{nm}$ a causa dell'elevata influenza che la rugosit\'a superficiale ha sui parametri calcolati. Il valore di $E_{IT}$ dovrebbe essere costante nei materiali omogenei ed elastici, ma questo non \'e evidentemente il caso del tessuto osseo che possiede una complicata struttura gerarchica. In tutte le serie sperimentali tra campioni ossei idratati e secchi sono state riscontrate notevoli differenze nel valore $E_{IT}$. Per i risultati ottenuti con la punta Berkovich, $E_{IT}$ \'e stato osservato variare tra $22$ e $\SI{26}{GPa}$ in condizioni asciutte, e tra $15$ e $\SI{20}{GPa}$ in presenza di liquido. La differenza percentuale tra i valori di $E_{IT}$ nei due stati \'e quindi di circa $36\%$ a basse profondit\'a e circa $20\%$ aumentando la profondit\'a. Per quanto riguarda la punta sferica, $E_{IT}$ ha mostrato valori notevolmente inferiori al caso precedente, $E_{IT}$ infatti varia tra $13$ e $\SI{16}{GPa}$ in asciutto, e tra $9$ e $\SI{14}{GPa}$ per campioni idratati. A basse profondit\'a $E_{IT}$ \'e maggiore di circa il $30\%$ per campioni asciutti, ma a $\SI{1000}{nm}$ il valore di $E_{IT}$ dei campioni umidi supera quello dei campioni asciutti di circa il $6\%$. La differenza del modulo di indentazione dei campioni nelle due diverse condizioni di idratazione pu\'o essere spiegata assumendo che la deidratazione porti ad una sostituzione dei deboli ponti idrogeno con legami peptidici molto pi\'u forti. Una maggiore compliance dei campioni umidi \'e invece suggerita dall'osservazione che in tali campioni le profondit\'a prestabilite sono state raggiunte applicando un carico inferiore che nei campioni asciutti. Modulo di indentazione e durezza elevati possono anche essere correlati ad un maggiore grado di mineralizzazione, che fornisce una struttura rigida ed evita la contrazione delle fibrille di collagene. Particelle minerali possono staccarsi dalle regioni vicino alla superficie dell'osso quando questo \'e immerso in un liquido. La tecnica di nanoindentazione \'e sensibile alla superficie e tale demineralizzazione potrebbe portare ad una riduzione del modulo elastico calcolato e ad una maggiore risposta viscoelastica. In ogni serie di prova, i valori di durezza hanno mostrato andamenti confrontabili a quelli del modulo di indentazione. Per entrambe le geometrie dell'indentatore, la differenza tra le due condizioni di idratazione \'e aumentata dal $62\%$ al $24\%$ aumentando la profondit\'a. Per la punta Berkovich, il valor medio di $H$ varia tra $820$ e $\SI{1000}{MPa}$ in condizioni asciutte, e tra $380$ e $\SI{670}{MPa}$ in condizioni idratate. Per la punta sferica, lo stesso valore varia tra $230$ e $\SI{350}{MPa}$, e tra $90$ to $\SI{230}{MPa}$ rispettivamente per campioni secchi e umidi. Il rapporto $E_{IT}$/$H_{IT}$ \'e una misura della relazione tra il comportamento plastico ed elastico del materiale. Ad elevate profondit\'a sono state osservate maggiori deformazioni plastiche anche per l'indentatore sferico, che ha comunque dimostrato un comportamento plastico inferiore all'indentatore di Berkovich. Il rapporto $E_{IT}$/$H_{IT}$ \'e stato osservato essere pi\'u elevato per campioni idratati, che significa un maggiore recovery viscoelastico. Per quanto riguarda i risultati ottenuti applicando le due soluzioni analitiche viscoelastiche, lo stato di idratazione \'e stato trovato essere il fattore pi\'u significativo per tutti i parametri calcolati. I moduli elastici e la viscosit\'a pi\'u elevati si sono osservati in condizioni asciutte, inoltre il valore del modulo elastico istantaneo $E_1$ \'e sempre stato maggiore di quello del corrispondente modulo elastico $E_2$. Questi risultati riflettono un pi\'u elevato comportamento tempo-dipendente del tessuto osseo idratato. Ad ogni modo, \'e stato notato che tutte queste differenze si affievoliscono aumentando la profondit\'a di penetrazione, suggerendo un'acquisizione di importanza di fenomeni di carattere plastico. In condizioni idratate, sono stati trovati valori di viscosit\'a molto bassi, suggerendo una risposta del materiale di carattere prevalentemente elastico. Non \'e stato, purtroppo, possibile analizzare "storage" e "loss" moduli calcolati in modalit\'a DMA a causa in un errore nel modello implementato dal software del nanoindentatore. Sono stati infatti forniti valori del "loss" modulo negativi che non hanno alcun significato fisico. Il rapporto $W_{el}/W_{tot}$ \'e una misura del contributo elastico al lavoro totale. Tale rapporto \'e stato osservato variare tra il $44$ e $50\%$ utilizzando una punta sferica, e tra il $25$ e $29\%$ utilizzando una punta Berkovich. I risultati utilizzando il primo tipo di punta sono stati significativamente influenzati dalla profondit\'a di penetrazione, ma non dallo stato di idratazione. Come aspettato, alle profondit\'a pi\'u elevate la punta sferica ha causato maggiore deformazione plastica. Al contrario, lo stato di idratazione \'e stato un fattore di significativa importanza per quanto riguarda le prove di indentazione con la punta Berkovich, infatti il rapporto $W_{el}/W_{tot}$ delle prove in condizioni umide \'e $10\%$ di quello in condizioni asciutte. Creep e recovery sono forme di deformazioni viscoelastiche. Questi fattori sono stati fortemente influenzati sia dalla profondit\'a di penetrazione che dalla condizione di idratazione. Nelle prove condotte su campioni asciutti, il recovery \'e stato inferiore al corrispondente creep, mentre il risultato opposto \'e stato osservato per i campioni umidi. Ancora una volta questi risultati mostrano il pi\'u elevato comportamento viscoelastico del tessuto osseo umido. Il presente lavoro ha studiato l'influenza dell'idratazione sulle propriet\'a del tessuto osseo attraverso prove di indentazione con due punte di differente geometria. \'E stata evidenziata l'importanza della viscoelasticit\'a nel tessuto osseo e ci\'o pu\'o essere un punto di partenza per approfondire la conoscenza delle propriet\'a meccaniche e del comportamento di tale tessuto.