Frequency and time domain analysis on fiber reinforced poroviscoelastic tissue: study on articular cartilage through nanoindentation tests at micrometric characteristic lengths

Articular cartilage (AC) is a paradigmatic tissue with respect to the concept of complex hierarchical tissue with structural function: it is inhomogeneous and anisotropic, it shows depth and time dependencies and it undergoes to large deformations. AC principal function of transferring loads between joints surfaces is performed by its specific microscopic structure: at these length scales, its characterization is still not well understood and recent works suggest interesting complexities that need deeper studies. This thesis is centered on the study of AC by making use of nanoindentation tests in both time and frequency domain, through experimental, numerical and analytical methods. The long term objective is focused on the developing of experimental and numerical methodologies for the early identification of AC pathologies. The superficial layers of AC play an important role in both the biomechanics of the tissue and the maintenance of its integrity. Averaged properties can describe the overall mechanical behavior but they cannot catch the specific aspects of the local organization. Nanoindentation technique is well suited to this latter purpose, instead. The introduction of the concepts of characteristic lengths and equivalent deformations allows to a better explanation of the results, giving the possibility to suggest relations between mechanical properties and specific microstructure. Two instruments are considered, an Atomic Force Microscope (AFM) and a Nanoindenter (NI): for the purpose of this thesis, they differ each other for the characteristic lengths and for the domain in which the experiments are carried out. The technique of dynamic mechanical analysis (DMA) is applied to a nanometric AFM–based nanoindentation whereas nanoindentation creep tests are used in conjuction with multiload tests at higher length scales. The dichotomy between poroelasticity (extrinsic phenomenon dependent on spatial derivative) and viscoelasticity (intrinsic phenomenon independent on spatial derivative) is investigated up to the role of the single bundle of fibers. The interest on high frequency behavior is related to the importance of instantaneous response (limit to the undrained condition) of the tissue. All the investigation are carried out on native AC. Harmonic nanoindentation tests have shown that the elastic properties are depth dependent for a range of frequency up to 250 Hz. In drained condition, the modulus shows a larger value with the larger tip than with the smaller one. Dissipative effects, instead, decrease with the characteristic length. A predominant poroelastic behavior is noted if the tissue is investigated with the micrometric tip, whereas a mainly viscoelastic behavior characterizes the nanometric one, that investigated the single boundle of collagen fibers. The NI is used in conjunction with the multiload creep test: recording creep data with different tips at different load levels, while remaining in the same indentation spot, allows the investigation of the tissue at different characteristic lengths avoiding effects of tissue variability. At micrometric lengths, a smaller tip results in a larger drained modulus, suggesting a dependence with the equivalent strain, and a predominant poroelastic behavior is evidenced. The poroelastic mechanical properties (estimated locally) are computed by using the Hertzian theory and by adapting the analytical solution of the consolidation of a poroelastic layer subjected to a confined compression to this kind of test. Proper numerical methods can help the explanation of experimental evidences by highlighting the effect of hidden (from an experimental point of view) parameters on the overall response. The problem of DMA test of spherical nanoindentation on poroelastic material is implemented in an homemade Matlab (MathWorks, Natick, MA, USA) based code. The effect of geometrical and constitutive parameters are studied. Radii and indentation depths are varied while an isotropic poroelastic material is considered: indentation radius has a larger effect on the real part of the material response than indentation depth. Anisotropy ratio, ratio between the transversal and the axial stiffness, and out - of - plane Poisson’s ratio of a transversely isotropic poroelastic material, instead, are varied maintaining a thermodynamic consistency: while the geometry is kept fixed, it is shown that the weight of dissipative effect increase when an highly anisotropic material is considered. The physical complexity of AC requires numerical models capable to take into account for all the single components and their mutual interactions, especially if a micrometrical characterization is the objective. One recent approach, indeed, is related to the direct modeling of tissues constituents and their interactions. In this thesis, a poroviscoelastic constitutive relation with a continuous fiber distribution is implemented in a user defined material subroutine for the commercial code Abaqus 6.8-EF1 (Simulia, Providence, RI, USA): the role of solid matrix, proteoglycans and collagen fibers are accounted for. The fiber distribution is modeled as a three parameters ellipsoid in an axisymmetric framework. A sensitivity analysis is performed on those parameters by using a confined compression stress relaxation tests. Only a preliminary attempt to apply this model to the collected experimental data is proposed: indeed, this material is used to obtain the input configuration for the dynamic code and it is shown that, for a fixed set of constitutive parameters (related to constituents), a unique fibers distribution permits to replicate the results obtained varying the indentation depth of 1 µm, from 0.5 to 1.5 µm from the surface. Finally, the protocol developed in time domain is used to evaluate the mechanical properties of engineered AC, when it is subjected to different treatments after injury: the estimated poroelastic parameters shown differences that can be positively correlated with the different microstructural arrangements. Therefore, this methodology appears a promising tool to be used for clinical applications.

La cartilagine articolare è un tessuto paradigmatico rispetto al concetto di tessuto complesso strutturato con funzione meccanica: è disomogeneo e anisotropo, mostra dipendenze da tempo e da profondità ed è sottoposto a grandi deformazioni. La sua funzione principale e’ di trasferire i carichi tra le superfici articolari: a lunghezze microscopiche, la sua caratterizzazione non è ancora ben compresa e lavori recenti suggeriscono delle complessità interessanti che necessitano di studi più approfonditi. Questa tesi è incentrata sullo studio della cartilagine articolare, facendo uso di test di nanoindentazione sia nel dominio del tempo che della frequenze, con metodi sperimentali, numerici e analitici. L'obiettivo a lungo termine è focalizzato sullo sviluppo di metodologie sperimentali e numeriche per l'identificazione precoce delle patologie a carico del tessuto. Gli strati superficiali svolgono un ruolo importante sia nella biomeccanica del tessuto che nel mantenimento della sua integrità. Proprietà medie possono descrivere il comportamento meccanico globale, ma non possono cogliere gli aspetti specifici dell'organizzazione locale. La tecnica della nanoindentazione è adatta a questo ultimo scopo, invece. L'introduzione dei concetti di lunghezza caratteristica e deformazione equivalente permette di spiegare meglio i risultati, dando la possibilità di suggerire relazioni tra le proprietà meccaniche e la microstruttura specifica. Due strumenti sono considerati, un microscopio a forza atomica (AFM) e un Nanoindentometro (NI): ai fini di questi tesi, gli strumenti si differenziano tra loro per le lunghezze caratteristiche e per il dominio in cui si svolgono gli esperimenti. La tecnica di analisi meccanica dinamica è applicata ad una nanoindentazione con AFM a scala nanometrica mentre le prove di creep sono utilizzati in combinazione con test di nanoindentazione multi - carico a scale superiori. La dicotomia tra poroelasticita’ (fenomeno estrinseco dipendente dalle derivate spaziali) e viscoelasticità (fenomeno intrinseco indipendente dalle derivate spaziali) viene analizzata fino al ruolo dei singoli fasci di fibre. L'interesse sul comportamento ad alta frequenza è legato all'importanza della risposta istantanea (limite alla condizione non drenata) del tessuto. Tutte le indagini sono eseguite su tessuto nativo. I test di oscillazione forzata hanno dimostrato che le proprietà elastiche sono dipendenti dalla profondità, almeno in un intervallo di frequenze fino a 250 Hz. Nella condizione drenata, il modulo di indentazione presenta un valore maggiore se investigato con la punta piu’ grande rispetto a quelle piu’ piccole. Gli effetti dissipativi, invece, diminuiscono con la lunghezza caratteristica. Un comportamento poroelastico predominante è evidenziato se il tessuto è indagato con la punta micrometrica, mentre un comportamento viscoelastico caratterizza quella nanometrica, che ha indagato il comportamento dei singoli fasci di collagene. Il NI è usato in combinazione con la prova di creep a diversi carichi: analizzando il tessuto con punte sferiche a raggi differenti e a differenti livelli di carico, pur rimanendo nel punto stesso sito, consente l'indagine del tessuto a diverse lunghezze caratteristiche evitando gli effetti della variabilità del tessuto. A lunghezze micrometriche, il modulo drenato e’ maggior nel caso di punta piu’ piccola, suggerendo una dipendenza dalla deformazione equivalente, mentre un il tessuto manifesta un comportamento poroelastico predominante. Le proprietà meccaniche, stimate localmente, sono calcolate utilizzando la teoria hertziana e adattando a questo tipo di test la soluzione analitica del consolidamento di uno strato poroelastico sottoposto ad una compressione non confinata. Adeguati metodi numerici possono aiutare la spiegazione di evidenze sperimentali, evidenziando l'effetto parametri nascosti (da un punto di vista sperimentale) sulla risposta complessiva. Il problema della prova di nanoindentazione dinamica sferica su materiale poroelastico è implementato in un codice Matlab (The MathWorks, Boston, MA, USA). Lo studio e’ incentrato sugli effetti sia dei parametri geometrici che di quelli costitutivi. Se si considera un materiale poroelastico isotropo sollecitato con punte di diverso raggio e a diverse penetrazioni, il raggio dell’indentatore ha un effetto maggiore sulla parte reale della risposta del materiale rispetto all’affondamento. Il rapporto di anisotropia, rapporto tra la rigidezza trasversale e quella assiale, e il coefficiente di Poisson fuori dal piano di un materiale poroelastico trasversalmente isotropo, invece, sono variati mantenendo una consistenza termodinamica: se la geometria è mantenuta fissa, si nota che l’effetto dissipativo aumenta se viene considerato un materiale fortemente anisotropo. La complessità fisica di questo tessuto richiede modelli numerici in grado di tener conto di tutti i singoli componenti e delle loro interazioni reciproche, specialmente se si pensa ad una caratterizzazione micrometrica. Un approccio recente, infatti, è legato alla modellazione diretta dei componenti del tessuto e delle loro interazioni. In questa tesi, una legame costitutivo poroviscoelastico con una distribuzione continua di fibre di collagene è implementato in una subroutine per il codice commerciale Abaqus 6.8-EF1 (Simulia, Providence, RI, USA): sono considerato i ruoli della matrice solida, dei proteoglicani e delle fibre collagene. La distribuzione delle fibre è modellata come un ellissoide a tre parametri in un approccio assialsimmetrico. Un'analisi di sensitività e’ effettuata sui parametri della distribuzione utilizzando un test di compressione non confinata combinata con una prova di rilassamento. L’applicazione alla prova di nanoindentazione nel tempo e all’analisi di dati sperimentali e’ limitata a prove qualitative. Viceversa, questo legame costitutivo e’ usato per ottenere una configurazione realistica da passare come inputo al codice dinamico e si nota che, fissando i parametri costitutivi relativi ai singoli componenti, un’unica distribuzione di fibre permette di replicare i risultati ottenuti variando la profondità di penetrazione di 1 um, da 0.5 a 1.5 micron dalla superficie. Infine, il protocollo sviluppato nel dominio del tempo viene utilizzato per valutare le proprietà meccaniche di cartilagine articolare ingegnerizzata, quando questa è sottoposta a diversi trattamenti dopo una lesione forzata : i parametri stimati mostrano differenze che possono essere correlate positivamente con le diverse organizzazioni microstrutturali. Pertanto, questa metodologia appare un promettente strumento da utilizzare per applicazioni cliniche.