Morphological analysis of cortical neurons cultured on carbon nanotubes and nanofibers

For future applications on microelectrode arrays (MEAs), in this work we investigated viability and neurite outgrowth of neuronal cells onto topographically and chemically modified surfaces. In particular purified carbon nanotubes (CNTs), electrospun SU8 carbonized (CNFs) and non-carbonized nanofibers (SU8NFs), flat stripes of SU8 thin film carbonized (CTFs) and non-carbonized (SU8TFs), and polyethylenimine (PEI) have been used, individually or in combination, as surface modifications. CNTs have been applied onto glass coverslips through a layer by layer (LBL) deposition method in which layers of PEI and CNT solution were deposited alternated on the surface. Varying the number of layers, we fabricated two types of CNT-samples: 3 layers (3LBL) and 9 layers (9LBL). All CNT samples were plasma treated after manufacturing. On the other end, the CNFs, SU8NFs, CTFs and SU8TFs were deposited on silicon substrates, plasma treated and coated with PEI at different concentrations, 0.1-0.001-0.00001 %. Dissociated E18 rat cortex neurons have been seeded on these substrates. Using calcein AM and ethidium bromide (EthD-1), cells have been stained and fluorescence microscopy applied. The images obtained were processed using NeuriteQuant, an ImageJ plugins, for cell counting and neurite extension measurements. Cell viability and neurite outgrowth was found to be the same on CNT(3LBL) and CNT(9LBL) samples but slightly inferior to PEI control samples. For the CNFs, SU8NFs, CTFs and SU8TFs tested, very few cells grew on them at concentration of 0.1 % PEI instead high viability and neurite outgrowth was found on these samples only plasma treated or coated with 0.00001 % PEI. Moreover, from the neurite analysis, we observed that CTF and CNF samples supported very good neurite development and branching showing that their application as coated materials for electrodes could be a successful solution in order to decrease the impedance and favor neuronal growth.

Per future applicazioni su microelectrode arrays (MEAs), abbiamo testato come cambiano la vitalità e lo sviluppo morfologico di cellule neuronali coltivate su superfici modificate sia topograficamente che chimicamente. In particolare, sono stati utilizzati nanotubi di carbonio (CNTs), nanofibre di carbonio (CNFs), nanofibre di SU8 prodotte attraverso l'electrospinning (SU8NFs), film sottili di carbonio (CTFs), film sottili di SU8 (SU8TF) e polietilenimmina (PEI), sia indipendentemente che in combinazione. I CNTs sono stati applicati su vetrini da coltura attraverso una deposizione layer by layer (LBL) che consiste nel depositare sulla superficie del campione, altrenativamente, uno strato di soluzione di PEI e uno di CNTs. Variando il numero di strati abbiamo ottenuto due tipi di campioni con coating di CNTs: 3 strati (3LBL) e 9 strati (9LBL). Questi campioni sono poi stati trattati al plasma per 30 secondi. Per quanto riguarda gli altri campioni, i coating in CNFs, SU8NFs, CTFs e SU8TFs, sono stati applicati su silicio, trattati al plasma e rivestiti con PEI a diverse concentrazioni: 0.1-0.001-0.00001%. I neuroni, ottenuti dalla dissociazione di cortecce cerebrali di ratto (E18), sono poi stati seminati sui campioni. Usando calceina Am e omodimero d'etidio (EthD-1) è stato effettuato il test di vitalità cellulare utilizzando la microscopia a fluorescenza. Le immagini ottenute sono state poi analizzate con NeuriteQuant, un plugin open surce per ImageJ, ottenedo la caratterizzazione morfologica dei neuroni in termini di grandezza del corpo cellulare, numero di neuriti e numero di diramazioni dei neuriti per cellula. Per quanto riguarda i campioni con coating in CNTs poche differenze significative sono state riscontrate tra i valori ottenuti per i CNT(3LBL), i CNT(9LBL) e il controllo in PEI. Al contrario, per i campioni con coating in CNFs, SU8NFs, CTFs e SU8TFs, insoddisfacenti valori di vitalità cellulare sono stati ottenuti a 0.1% PEI mentre ottimi risultati sono stati ottenuti sia a 0.001% che a 0.00001% PEI. Inoltre, per quanto riguarda la morfologia cellulare, si è osservato che sia i campioni in CNFs che CTFs supportano un buon sviluppo cellulare, sia in termini di neuriti che diramazioni. Tutti i materiali testati risultano quindi essere biocompatibili e, le CNFs ancor più dei CNTs, potrebbero fornire ottimi risultati in future applicazioni su MEAs.