Metabolic network-based modeling of micro-organisms: Evaluation of black- and grey-box flux model structures

Micro-organisms nowadays are largely used in many fields of industry, such as food industry, pharmaceutical industry, biofuels etc. With the spread of biotechnology, a new science which aims to quantitative understanding of organisms was born, called predictive microbiology. Considering the enormous complexity, variability and nonlinearity of biological systems, a quantitative understanding necessarily requires computational models. To describe micro-organisms, information at different scales must be collected, from the macroscopic scale of the reactor, which considers the entire microbial population, to the microscopic scale, which describes what happens inside and in the immediate around of a single cell. While measurements of the macroscopic variables are easily available, to experimentally characterize the microscopic scale is much more difficult. Nevertheless, a recent technique called isotopomer analysis allows to measure the intracellular states, i.e., reaction rates, called fluxes, and metabolite concentrations. This method consists of feeding labeled carbon atoms to the cell, registering their movements through the cellular metabolism. A kind of modeling for biological system which is very promising is based on metabolic networks. Metabolic networks are a blueprint of cellular metabolism, reporting stoichiometric information about most of the metabolites which participate to the cellular growth and the reactions between them. Using metabolic networks, a primary model, i.e., a model which describes the natural dynamics of the cellular metabolite, can be formulated which deals with the lack of precise experimental information at the intracellular scale. In fact, it requires a much inferior number of data than the determination of the kinetic equations of all the numerous intracellular reactions. This is possible thanks to some assumptions, which are at the base of metabolic flux analysis (MFA): the bacterial population is considered to be homogeneous, assuming the concentration of metabolites in the microscopic medium around the cell to be equal to the macroscopic, and then measurable, concentration; the intracellular dynamics are disregarded, assuming the system to be always at the metabolic pseudo-steady state, in equilibrium with the extracellular variables. These are quite strong hypotheses, but they are sufficiently satisfied considering simple, liquid media under moderate environmental conditions. The extension of MFA to systems not at the metabolic steady state is called dynamic metabolic flux analysis (dMFA). The main goal which predictive microbiology aims to is to formulate a model able to unravel the complexity of the micro-organism, predicting the response of the biological system to the environmental stimuli. Such a model would allow to implement online control strategies to optimize every variable and aspect of the process, pushing the bacterial culture to accomplish the industrial interests. This study moves toward this perspective, aiming to solve only with online inputs the primary dynamic model of the biological system. The issue is to completely characterize the model as function of the extracellular variables. According with dMFA, both the extracellular and the intracellular variables continuously vary in time, but while the extracellular states can be determined in real time during the fermentation process, the isotopomer analysis for measuring the intracellular ones is a discontinuous method. A relation which links the variation of the fluxes to the dynamic evolution of the extracellular concentrations must be found. Two different approaches to find this relation will be tested. The so-called grey-box approach is based on flux balance analysis (FBA), which follows an evolutionary logic. According with the Darwinian theory, the time has transformed the micro-organism into a perfect optimizer of its own metabolism, and the fluxes should vary to always optimizing a biological objective function. On the contrary, the second approach is simply based on a black-box model, much more general and flexible, and whose validity on homogeneous media under moderate environmental conditions has already been widely confirmed. Nevertheless, the limit of this kind of model is the robustness, its validity under a wider range of experimental conditions and in more realistic situations. The results of these approaches will be tested on two case studies: a small-scale simulated network, called toy network, whose data were artificially generated with simple relations between fluxes and concentrations; a bigger network which describes an E. coli population engineered to produce 1,3-propanediol (PDO). This chemical is used in industry to produce plastic, as an additive to a variety of products such as coatings, composites, adhesives etc and as a solvent. Hence, the case study resembles a real industrial fermentation. The study moves in a very recent and innovative research field, exploring the potentiality of a previously untested modeling approach. Many problematic issue about the application of FBA will be highlighted and examined, while the black-box approach will return some interesting results. The limit of this approach remains the extrapolation outside the range of experimental conditions, but still it represents a starting model to be improved in future and enriched with biological and mechanistic information. The perspective of the implementation of a real-time, efficient and effective model which revolutionizes the bioprocesses is still far nowadays, but much can still be expected from a fresh and ongoing research area such as predictive microbiology.

I micro-organismi sono oggigiorno largamente utilizzati in molti campi industriali, come industria alimentare, farmaceutica, biocombustibili ecc. Con la crescente diffusione delle biotecnologie, è nata una nuova scienza che aspira ad una comprensione quantitativa degli organismi, chiamata microbiologia predittiva. Considerando la grande complessità, variabilità e non linearità dei sistemi biologici, una comprensione quantitativa richiede necessariamente l'uso di modelli computazionali. Per descrivere i microorganismi, devono essere combinate informazioni provenienti da scale dimensionali diverse, dalla macroscala, che considera l'intera popolazione batterica, alla microscala, che descrive ciò che avviene dentro e nell'immediato intorno di una singola cellula. Mentre le variabili alla macroscala sono facilmente misurabili, caratterizzare sperimentalmente la microscala è ben più complicato. Nonostante questo, una recente tecnica sperimentale chiamata analisi isotopica permette di misurare le variabili intracellulari, ovvero le velocità di reazione, dette flussi, e le concentrazioni dei metaboliti. Tale metodo consiste nel nutrire la cellula con atomi di carbonio identificabili, registrando come questi si muovono all'interno della cellula attraverso il suo metabolismo. Un approccio di modellazione di sistemi biologici particolarmente promettente è basato sui network metabolici (reti metaboliche). I network metabolici sono mappe del metabolismo cellulare, che riportano informazioni stechiometriche riguardo alla maggior parte dei metaboliti che partecipano alla crescita della cellula ed alle reazioni che li legano. Sfruttando i network metabolici, è possibile formulare un modello primario, ovvero un modello che descrive le naturali dinamiche dei metaboliti cellulari, nonostante la scarsità di informazioni sperimentali precise a livello intracellulare. Questo richiede molti meno dati rispetto alla determinazione delle equazioni cinetiche di tutte le numerose reazioni intracellulari. Ciò è reso possibile grazie ad alcune assunzioni semplificative, che sono alla base dell'analisi dei flussi metabolici (MFA): la popolazione batterica è considerata essere omogenea, considerando la concentrazione dei metaboliti nell'ambiente microscopico che circonda la cellula pari alla rispettiva concentrazione macroscopica; le dinamiche intracellulari sono trascurate, assumendo che il sistema sia sempre in uno stato pseudo stazionario, in equilibrio con l'ambiente extracellulare. L'estensione della MFA a sistemi in stato metabolico non stazionario è chiamata analisi dinamica dei flussi metabolici (dMFA). Il principale obiettivo cui la microbiologia predittiva aspira è la formulazione di un modello capace di catturare ed esprimere la complessità del microorganismo, prevedendo la reazione del sistema biologico a stimoli ambientali esterni. Tale modello permetterebbe di implementare strategie di controllo in tempo reale per ottimizzare ogni variabile ed aspetto del processo, spingendo la coltura cellulare a soddisfare gli interessi industriali. Questo studio è da intendersi alla luce di tale prospettiva, dato che aspira a risolvere il modello dinamico primario del sistema biologico sfruttando solo i dati disponibili online durante il processo. Il problema sta nel caratterizzare completamente il modello in funzione delle variabili extracellulari. Secondo la dMFA, infatti, sia le variabili extracellulari che quelli intracellulari variano nel tempo, ma mentre le prime possono essere determinate in tempo reale durante la fermentazione, l'analisi isotopica per la misurazione delle seconde è un metodo discontinuo. Bisogna quindi trovare una relazione che correli la variazione dei flussi all'evoluzione dinamica delle concentrazioni extracellulari. Due diversi approcci per esprimere questa relazione sono stati sperimentati. Il cosiddetto approccio a scatola grigia è basato sull'analisi di bilanciamento dei flussi (FBA), che segue una logica evoluzionistica. Secondo le teorie darwiniane, infatti, il tempo ha trasformato i microorganismi in perfetti ottimizzatori del loro stesso metabolismo, e i flussi devono variare ottimizzando in ogni istante una funzione obbiettivo biologica. Al contrario, il secondo approccio è semplicemente basato su un modello a scatola nera, molto più generale e flessibile, la cui validità per sistemi in mezzo omogeneo e sotto moderate condizioni ambientali è stata largamente confermata. Non di meno, il limite di questi modelli è la robustezza, ovvero l'estensione a condizioni ambientali diverse ed in situazioni più realistiche. I risultati di questi approcci sono testati su due casi: un piccolo network simulato, i cui dati sono stati generati artificialmente imponendo semplici relazioni tra i flussi e le concentrazioni; un network più grande, che descrive una popolazione di E. coli ingegnerizzata per la produzione di 1,3-propandiolo (PDO). Questa sostanza è usata industrialmente nella produzione di plastiche, come additivo per compositi, rivestimenti, additivi ecc. e come solvente. Questo esempio ricalca quindi una reale fermentazione industriale. Lo studio si muove in un campo di ricerca molto recente ed innovativo, esplorando le potenzialità di un approccio modellistico mai testato prima. Molte problematiche relative all'uso della FBA sono evidenziate ed esaminate, mentre l'approccio sperimentale ha prodotto alcuni risulti utili. Il limite di questo approccio rimane sempre l'estrapolazione fuori dalle condizioni sperimentali, ma rappresenta comunque un modello di partenza da migliorare in futuro ed arricchire di informazioni biologiche e meccanicistiche. La prospettiva di implementare un modello in tempo reale efficiente e preciso, capace di rivoluzionare i bioprocessi, è ancora lontana, ma molto si può ancora sperare da un campo di ricerca fresco ed in continua crescita come appare la microbiologia predittiva.