Progettazione e sviluppo di uno strumento per analisi biologiche mediante dielettroforesi basato su lab-on-chip

In recent years the interest in integrated biological analysis systems has been growing in the field of medical diagnostics, environmental monitoring, agro-food field and biomedical research. In particular, we have seen a progressive miniaturization of used devices, which permitted mobility, automation and convenience in mass production. The device’s miniaturization is obtainable, today, especially using MEMS (Micro electro-mechanical Systems) technology. A MEMS device is a highly miniaturized microsystem which can integrate functions of electric, mechanical, optical, and fluidic nature on the same semiconductor substrate. All components of a MEMS device, even those that are not strictly electronic, are made using standard microelectronics processes and tools, making the manufacturing process cheap and easily implementable by integrated circuits producers. Recently, in addition to this integration, another one was born at an even higher level, in order to integrate different laboratory functions, that are normally obtainable by only using different macroscopic instruments, on the same device. Such devices are named Lab-On-Chip (LOC) and their development was possible thanks to the recent progress in the microfluidic field and to the use of organic materials. The use of Lab-On-Chip allows many benefits: costs reduction, an increase in sensibility, efficiency of the processes and rapidity, and the use of a limited quantity of samples and reagents. The functions generally integrated on Lab-On-Chip are specially functions of particle and cellular manipulation, like filtering, sorting and counting of cellular populations, and chemical and genetic related functions, like DNA extractions, PCR, DNA Sequencing, etc. In this thesis work, carried out at STMicroelectronics, AST group (Advanced System Technology) in Agrate Brianza, in particular, we developed a complete system for cell separation using Dielectrophoresis (DEP) based on Lab-On-Chip and we performed many experimental tests using cell suspensions of known electrical conductivity. The purpose of the experimental tests was to confirm the predicted behaviour of the cells in the various electrodes configurations designed and to demonstrate the efficacy of the system in sorting applications. In particular, yeast cells Saccharomyces Cerevisiae and red blood cells healty and infected by Plasmodium, the human malaria parasite, were used. Dielectrophoresis does not require a process of marking. It consists of the movement of neutral particles due to variation of polarization induced by an external non-uniform electric field. It is possible, for example, by using metals electrodes, deposed on the chip, and applying time-variable electric signals on them. The system we made includes a microfluidic chip, an electronic board, which allows the control of the electric signal applied to electrodes necessary for Dielectrophoresis, and an optical microscope system that allows visual inspection and eventually cell counting. The system also includes a control software. Moreover, we designed various configurations of electrodes and chips, making the system suitable for many applications. In this paper, the description of the total work performed is divided into six chapters, each on related to a particular aspect of the system. In the first chapter, the theory of Dielectrophoresis is discussed and the principal mathematical laws and figures of merits are shown. In addition, the chapter gives a brief overview of some variants of the technique found in literature and of the applications. The second chapter shows the configurations of electrodes designed and tested during the thesis work, including the results of the numeric simulations made by the use of COMSOL Multiphysics, a software for modelling and simulating physicsbased complex problems. The main technologic steps and techniques used to develop chips are described, too. The third chapter provides a detailed description of the system’s electronic part, explaining, in particular, the working of the principal components like the Direct Digital Synthesizer (DDS) and the Current Feedback Amplifier (CFA). System’s software and firmware are briefly described, too. The fourth chapter describes the optical analysis system; starting with the optical microscopy theory the principal technical choices are justified and the results in terms of performance are shown. This chapter, moreover, shows all the mechanical parts designed with the CAD 3D software SolidWorks that form the prototype of the system. In the fifth chapter the electrical models used to describe the cells used in experimental tests are presented and then the latter are discussed starting from the expected results of the models to the experimental proofs. In the sixth chapter, finally, the results we obtained are summarized, pointing out the improvable aspects, and the possible future evolutions are mentioned.

Negli ultimi anni l’interesse verso i sistemi di analisi biologica integrati è notevolmente aumentato nel campo della diagnostica medicale, del monitoraggio ambientale, del settore agro-food e della ricerca biomedica. In particolare, si è assistito a una progressiva miniaturizzazione dei dispositivi utilizzati, che ha consentito portabilità, automazione e convenienza nella produzione di massa. La miniaturizzazione dei dispositivi è ottenibile, oggi, soprattutto sfruttando la tecnologia MEMS (Micro electro-mechanical Systems). Un dispositivo MEMS è un microsistema altamente miniaturizzato che può integrare funzioni di natura elettronica, meccanica, ottica e di gestione dei fluidi sullo stesso substrato di semiconduttore. Tutte le componenti di un dispositivo MEMS, anche quelle non strettamente elettroniche, vengono realizzate utilizzando i processi e gli strumenti standard per la produzione microelettronica, rendendo, così, il processo di fabbricazione economico e attuabile facilmente dai produttori di circuiti integrati. Recentemente, oltre a questa integrazione, ne è nata una ad un livello ancora più elevato, atta a integrare sullo stesso dispositivo diverse funzioni di laboratorio, normalmente ottenibili solo tramite differenti strumenti macroscopici. Tali dispositivi prendono il nome di Lab-On-Chip (LOC) e il loro sviluppo è stato possibile anche grazie ai recenti sviluppi nell’ambito della microfluidica e grazie all’utilizzo di materiali organici. I vantaggi ottenibili dall’utilizzo dei Lab-On-Chip sono molteplici: riduzione dei costi, maggior sensibilità ed efficienza delle operazioni svolte, maggior rapidità ed utilizzo di campioni e reagenti limitato. Per quanto riguarda le funzioni comunemente integrate sui Lab-On-Chip, si hanno soprattutto funzioni di manipolazione particellare e cellulare, come operazioni di filtraggio, sorting e conteggio di popolazioni cellulari, e funzioni chimiche e legate alla genetica, come estrazioni di DNA, PCR, DNA Sequencing, etc.. In questo lavoro di tesi, realizzato presso il gruppo AST (Advanced System Technology) di STMicroelectronics nella sede di Agrate Brianza, in particolare, si è sviluppato un sistema completo di separazione cellulare tramite Dielettroforesi (DEP) basato su Lab-On-Chip e sono state eseguite numerose prove sperimentali utilizzando sospensioni cellulari, aventi conducibilità elettrica nota e contenenti determinate cellule. Lo scopo delle prove sperimentali è stato quello di confermare i comportamenti previsti dalle cellule nelle varie configurazioni di elettrodi progettate e di provare l’efficacia del sistema nella separazione cellulare. In particolare, sono state utilizzate cellule di lievito Saccharomyces Cerevisiae e globuli rossi sani e infettati da Plasmodium, l’agente eziologico della malaria. La Dielettroforesi è una tecnica che non richiede un processo di marcatura e che consiste nella movimentazione di particelle neutre per effetto della variazione di polarizzazione indotta dall’applicazione di un campo elettrico esterno non uniforme. Ciò è possibile, per esempio, utilizzando degli elettrodi di metallo, depositati sul chip, e applicando a questi dei segnali elettrici variabili nel tempo. Il sistema realizzato è costituito da un chip con microfluidica, da una scheda elettronica, che consente il controllo del segnale elettrico applicato agli elettrodi necessari ad attuare la dielettroforesi, e da un sistema di microscopia ottica che consente analisi visiva ed eventuale conteggio delle popolazioni, oltre che da un software di controllo. Sono state, inoltre, progettate varie configurazioni di elettrodi su chip, rendendo il sistema adatto a molteplici utilizzi e applicazioni. Il presente elaborato di tesi è articolato in sei capitoli, ognuno specifico per un determinato aspetto affrontato. Nel primo capitolo viene discussa in dettaglio la tecnica della Dielettroforesi, vengono mostrate le principali leggi matematiche che la descrivono ed evidenziati i principali fattori di merito. Viene fatto cenno, inoltre, ad alcune varianti esistenti in letteratura e alle varie possibili applicazioni della tecnica. Nel secondo capitolo vengono mostrate le configurazioni di elettrodi realizzate e sperimentate durante il lavoro di tesi, inclusi i risultati ottenuti dalle simulazioni numeriche realizzate per mezzo di COMSOL Multiphysics, un software di simulazione agli elementi finiti di sistemi multifisici complessi. Vengono descritti, inoltre, i passi tecnologici e le tecniche con cui sono stati realizzati i chip. Il terzo capitolo offre una dettagliata descrizione della parte elettronica del sistema realizzato, illustrando il funzionamento dei componenti più importanti come il Direct Digital Synthesizer (DDS) e il Current Feedback Amplifier (CFA). Vengono descritti schematicamente, inoltre, il firmware e il software scritti per il sistema. Nel quarto capitolo viene discusso il sistema di analisi ottica realizzato; partendo dalla teoria sulla microscopia ottica vengono descritte le scelte tecniche realizzate e mostrati i risultati ottenuti in termini di prestazioni. In questo capitolo, inoltre, vengono mostrate in dettaglio tutte le parti meccaniche, progettate con il software SolidWorks, che costituiscono il prototipo del sistema realizzato. Nel quinto capitolo vengono prima esposti i modelli utilizzati per la descrizione delle specie cellulari utilizzate negli esperimenti e poi questi ultimi vengono discussi partendo dalle previsioni dei modelli fino ad arrivare alle conferme sperimentali. Nel sesto capitolo, infine, vengono riassunti i risultati ottenuti, evidenziando gli elementi migliorabili, e viene fatto cenno alle possibili evoluzioni future.